【原创】miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总

最近楼主才回来，由于很长时间不做这方面的工作了，很多新概念和新方法可能跟不上大家了，说的不对请见谅啊。感谢大家的踊跃发言。
最近看到很多战友在做miRNA的荧光定量PCR检测试验。也没看见有专门的讨论帖，拿自己以前做的试验晒晒。开个帖子欢迎大家来提问题、讨论。
另外希望各位战友有用没用千万看贴回个贴阿，以免此帖沦丧无尽之海。:D:D:D:D

目录如下：
一、MiRNA简介
二、反转录引物分类以及设计原理
三、引物探针设计
四、试验操作流程
1、RNA提取
2、反转录
3、荧光定量PCR
一、miRNA简介
小 RNA是 19~28nt的调控RNA分子，主要包括微 RNA(micro RNA，miRNA)和小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)两类，其中的miRNAs成为继 siRNAs之后新的研究热点之一，名列2002年和2003年美国《科学》杂志评出的年度十大科学成就。
miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约70 nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的3 端非编码区域(3-untranslated region，3 UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。
在miRNA公共数据库miRbase (http://www.mirbase.org/)中已经有1W多条来自不同物种的miRNA序列。

MiRNA检测方法
要了解miRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA基因的表达。因此，miRNA表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。但是由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。常用的检测方法有：
1.1 Northern blotting
1.2 核糖核酸酶保护分析以及基于此方法的液相杂交。
1.3 RT-PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平， 其他基于PCR技术检测miRNA的方法有
引物延伸法，就是在引物的5 末端加一个特异标记，可以定量测定低丰度的RNA含量；
原位杂交技术（CISH,FISH）可以方便的检测miRNA的时空表达的差异。
1.4 芯片(microarrays)技术[46,47]是一种较快的研究miRNA表达的方法。

miRNA qPCR实验检测流程示例

• 概述
• 背景资料
• 实验内容
• 实验主要仪器和试剂
• 实验操作
• 结果分析

一：概述

microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程

二：背景资料

• 检测人脑组织中miRNA的表达。
• 所选的miRNA及其扩增长度信息如下：

  	Primer ID	Mature_Acc	Mature_ID	PCR_SIZE
  1	hsmq-0031_01	MIMAT0000069	has-miR-16	75
  2	hsmq-0032_01	MIMAT0000422	hsa-miR-124	73
  3	hsmq-0033_01	MIMAT0000443	hsa-miR-125a-5p	77
  4	hsmq-0034_01	MIMAT0000423	hsa-miR-125b	75
  5	hsmq-0035_01	MIMAT0000429	hsa-miR-137	76
  6	hsmq-0036_01	MIMAT0000250	hsa-miR-139-5p	75
  7	hsmq-0037_01	MIMAT0000437	hsa-miR-145	76
  8	hsmq-0038_01	MIMAT0000450	hsa-miR-149	76
  9	hsmq-0039_01	MIMAT0000439	hsa-miR-153	75
  10	hsmq-0040_01	MIMAT0000452	hsa-miR-154	75
  11	hsmq-0041_01	MIMAT0000259	hsa-miR-182	77
  12	hsmq-0042_01	MIMAT0000261	hsa-miR-183	75
  13	hsmq-0043_01	MIMAT0000458	hsa-miR-190	75
  14	hsmq-0044_01	MIMAT0000276	hsa-miR-219-5p	74
  15	hsmq-0045_01	MIMAT0000077	hsa-miR-22	75
  16	hsmq-0046_01	MIMAT0000082	hsa-miR-26a	75
  17	hsmq-0047_01	MIMAT0000100	hsa-miR-29b	76
  18	hsmq-0048_01	MIMAT0000244	hsa-miR-30c	76
  19	hsmq-0049_01	MIMAT0000441	hsa-miR-9	76
  20	hsmq-0050_01	MIMAT0000689	hsa-miR-99b	75
  21	hsnRNA-U6_01	M14486	hsnRNA-U6	81

三：实验内容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析

四：实验主要仪器和试剂

• 主要实验仪器

冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System

• 主要实验试剂

TRIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、 miRNA qRT-PCR Detection Kit：GeneCopoeia (Cat. No. AOMD-Q050 )

五：实验操作

前期准备

为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行

利用miRNA qRT-PCR Detection Kit进行实验检测的流程示意图图1：miRNA qPCR Detection流程示意图

Total RNA抽提

• 样品处理
  
  取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞。
  
  （Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×10⁷细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为悬浮细胞，离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×10⁷细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞）。
  
  
• 相分离
  
  室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。
  
  
• RNA沉淀
  
  小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。
  
  
• RNA洗涤
  
  去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。
  
  
• RNA溶解
  
  风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。
  
  
• RNA浓度测定
  
  吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。
  
  Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD₂₆₀×稀释倍数）
  
  
• RNA电泳检测
• 7.1 变性胶制备
  
  取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
  
  
• 7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops)
  
  取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中
  
  
• 7.3 RNA样品处理
  
  取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳
  
  
• 7.4 RNA电泳
  
  先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。
  
  
• RNA抽提结果
• 8.1. RNA电泳图（取3ul RNA 样品）：
• 8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀

  RNA来源	RNA浓度(ng/μL )	OD 260/OD280
  人脑组织	3470	1.90

miRNA 3’端进行加“Poly A”处理

• 融解加“PolyA”反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
• PolyA Reaction 反应液的配制在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL

  试剂组分	体积	终浓度
  Total RNA		2μg
  2.5U/μLPolyA Polymerase	1μL	2.5U
  10×PolyA Polymerase Buffer	2μL	1×
  10×rATP Solution	2μL	1×
  ddH2O(RNase/DNase free)	补至20μL

  
  
  在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。Total RNA使用量可在100ng～10μg之间调整，如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之间调整。
  
  
• PolyA反应
  
  混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃。
  
  

Poly A化的RNA进行反转录反应

• 融解反转录反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
• RNA-Primer Mix 的配制反应在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL

  试剂组分	体积	终浓度
  PolyA反应液	2μL
  25×Oligo dT Adaptor	1μL	1×
  ddH2O(RNase/DNasfree)	10μL
  Final Volume	13μL

  
  
  混匀RNA-Primer Mix，短暂离心，直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。
  
  
• 配制反转录反应液在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。

  试剂组分	体积	终浓度
  RNA-Primer Mix	13μL
  5×RT Reaction Buffer	5μL	1×
  25mM dNTP	1μL	1mM
  25U/μL RNase Inhibitor	1μL	25U
  200U/μL M-MLV RTase (RNase H free)	1μL	200U
  ddH2O(RNase/DNase free)	4μL
  Final Volume	25μL

• 反转录反应
  
  混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。 所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。
  
  

qPCR 检测miRNA.

• miRNA检测引物设计
  
  miRNA qRT-PCR Detection Kit中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物：“Universal adaptor PCR Primer”，Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。因为miRNA序列长度一般都在18～24nt之间，所以其检测的Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体，其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。
  
  
• miRNA qPCR Forward Primer 设计举例（以小鼠mmu-miR-125b-5p为例）：
  
  在miRNA Database中查找检测的miRNA序列，如下图所示：miRNA Database：http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL
  
  则其Forward 检测引物可为：

  miRNA sequence	ucccugagacccuaacuuguga
  Primer sequence	tccctgagaccctaacttgtga （Tm：58.8）

• 融解2×AllinOne^TM qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
• 冰上进行qPCR反应液的配制（所有miRNA进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No template control）测试）

  试剂组分	体积	终浓度
  2×AllinOneTM qPCR Mix	10μL	1×
  qPCR Forward Primer（2μM）	2μL	0.2μM
  Universal Adaptor PCR （2μM）	2μL	0.2μM
  1st strand cDNA（diluted 1:5）	2μL
  ddH2O	4μL
  Final Volume	20μL

• 2×AllinOne^TM qPCR Mix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。
• Rox Reference Dye 使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪，如ABI的定量PCR仪。
• 引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
• 1^st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用 ，防止反转录体系对qPCR体系的影响。
• 充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。
• qPCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）

  循环数	步骤	温度	时间	检测
  1	预变性	95℃	10min	否
  	变性	95℃	10sec	否
  40	退火	57℃	20sec	否
  	延伸	72℃	10sec	是

  对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）

  检测温度范围	升温速率	恒温时间	检测
  70℃～95℃	0.5℃/次	6 sec/次	是
  30℃		30sec	否

• 2×AllinOne^TM qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。
• 因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性，在检测时应严格控制退火温度，防止出现非特异性扩增。
• 进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt，为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右（miRNA序列一般为22nt左右），所以延伸只需10sec即可。对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃～83℃范围内，如果超出此范围，建议使用别的方法来验证产物的特异性（如电泳）。


以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器，如使用的为不同公司的定量PCR仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。

六:结果分析

• 20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果

  融解曲线图	扩增曲线图

  
  
  
• 20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值

  	Primer ID	Mature_ID	PCR_SIZE	组织	Sample Ave. Ct	胶泳道
  1	hsmq-0031_01	has-miR-16	75	脑	27.02	1
  2	hsmq-0032_01	hsa-miR-124	73	脑	22.98	2
  3	hsmq-0033_01	hsa-miR-125a-5p	77	脑	27.81	3
  4	hsmq-0034_01	hsa-miR-125b	75	脑	22.58	4
  5	hsmq-0035_01	hsa-miR-137	76	脑	28.51	5
  6	hsmq-0036_01	hsa-miR-139-5p	75	脑	30.66	6
  7	hsmq-0037_01	hsa-miR-145	76	脑	24.7	7
  8	hsmq-0038_01	hsa-miR-149	76	脑	29.71	8
  9	hsmq-0039_01	hsa-miR-153	75	脑	27.61	9
  10	hsmq-0040_01	hsa-miR-154	75	脑	30.39	10
  11	hsmq-0041_01	hsa-miR-182	77	脑	34.64	11
  12	hsmq-0042_01	hsa-miR-183	75	脑	33.86	12
  13	hsmq-0043_01	hsa-miR-190	75	脑	32.28	13
  14	hsmq-0044_01	hsa-miR-219-5p	74	脑	28.16	14
  15	hsmq-0045_01	hsa-miR-22	75	脑	24.09	15
  16	hsmq-0046_01	hsa-miR-26a	75	脑	22.66	16
  17	hsmq-0047_01	hsa-miR-29b	76	脑	26.72	17
  18	hsmq-0048_01	hsa-miR-30c	76	脑	26.54	18
  19	hsmq-0049_01	hsa-miR-9	76	脑	23.11	19
  20	hsmq-0050_01	hsa-miR-99b	75	脑	27.06	20
  21	hsnRNA-U6_01	M14486	81	脑	22.26	21

推荐miRNA检测的一种Taqman 水解探针法。
作者采用了罗氏的探针，特异性比不上ABI的，但是成本和sybgreen的价格差不多，效果要比sybgreen好很多。

目前市场上面 ABI的Taqman miRNA 是miRNA 检测的金标准。

另外常用的还有基于 stem-loop的 （stem loop 是ABI的专利，所以正规的大公司都不会有Stem loop的试剂盒）
1. Sybgreen方法 （客户群最多，但是效果不稳定）
2. 自行设计的Taqman方法 （由于合成的探针是国内的普通探针大概20多个bp比ABI的MGB探针至少要多出6个bp，再加上引物常常会把miRNA挤的很满）

基于加尾方法的
1. Qiagen公司的试剂
2. Exiqon公司的试剂 采用了锁核酸技术 同时有人的全miRNA基因表达芯片产品

• 在miRNA中的应用.pdf(219.14k)

非常谢谢lz的建议！
你所说的“普通PCR”是指什么？非microRNA，某基因的mRNA翻转录产物PCR？microRN***段小，其PCR产物在琼脂糖凝胶上可以看到条带吗？

四、试验操作流程
1、RNA提取
在以上两种RT引物中，Ologod(T)特异引物所需要的RNA尽量是用特殊试剂盒提取的小RNA，而茎环状结构RT引物需要RNA正常提取就好。
另外由于所需样本不同RNA提取方法也不完全相同，普通组织样本和细胞可以研磨用Trizol＋氯仿抽提；血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。

2、反转录
确认用Oligod(T)特异RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。
反转录的酶没有特殊要求，操作请按照各自反转录酶的说明书进行就好。这里特别注意的是：反转录过程中用到的RT引物（常规的是随机引物、Oligod(T)和特异引物）是前面提到的Ologod(T)特异引物和茎环状结构RT引物，它们分别属于Oligod(T)和特异引物范畴，在反转录中不需要另外添加其他RT引物。
在确定反转录温度中请特别注意您使用的是哪一种RT引物，而设定相应的反转录温度。

3、荧光定量PCR
优化PCR体系（引物浓度、Mg浓度、dNTP浓度、退火温度等），正常操作。

――――――――The End.――――――

下面有关于以上两种反转录引物的设计的文献两篇，喜欢的自行下载，免费。

另外提供两篇RT引物设计的文献供大家参考（Loop RT Primer）。

• microRNA by real-time PCR in gastric carcinoma.pdf(1587.75k)

另外提供两篇RT引物设计的文献供大家参考（Oligod(T)RT引物）。

• 实时定量PCR阵列检测小鼠大脑组织microRNA表达谱.pdf(410.55k)

有什么问题欢迎大家来这里讨论。

lz您好，我用的是燃料法，上海吉玛的试剂盒。跑了两周的标准曲线，刚开始扩增效率一直只有74%，非特异性扩增也比较多，今天把循环条件改成了三步法后，非特异性扩增只有一个孔有，但扩增效率却增高到118%,这个是引物的问题吗？结果没有偏离很大的数据。还有，我的阴性对照组，经常扩增曲线，我昨天把所有的试剂都换用了新的了，操作也很注意预防污染，比如换工作区操作，擦洗工作台等，加样时也是先加的阴性对照，标准曲线的加样先后按浓度从低到高孔的顺序加的，最好加cDNA，我这些是怎么回事呢？我怀疑是我的引物设计的不好。麻烦楼主帮忙分析下吧，谢谢！

我觉得是我的引物没有设计好，所以可能有二聚体的形成，导致阴性对照有扩增曲线和高扩增效率，请大家帮忙分析下，嘿嘿。

lz 如果用looped rt引物，反转录时， 应不应该有 rna和引物混合 加热 再退火这一步骤。常规rtprotocol里都有这一步。不过如果反转录mirna时 这样会不会使looped引物不能很好区分pre-mirna和成熟rna，因为变性后loop的位阻效应就没了。