【求助】PCR产物切胶回收后浓度总是非常低，都要疯了。

小弟最近在做PGL3的重组质粒，想要把OBR的启动子连接到PGL3上，通过PCR技术我得到很好的目的条带，亮度好，特异性也好，但是每次切胶回收都浓度非常低，只有十几ng/ul。甚至四管PCR产物和在一起回收也是这么低，急死了。别人一管PCR回收都能到50ng/ul.我的总是收不到，试剂盒没有问题，别人用的很好啊，操作也没问题，别人替我回收过，也是没有回收回来，浓度也是十几ng/ul.现在要疯了，PCR产物得不到就没办法酶切，更别谈连接转化了。求求给位了，求求给位，这事怎么回事？？？？？？？？？？？？感激不尽啊，感激不尽。

1、如果试剂盒没问题的话，考虑一下片段大小。如果太小的话（500bp或以下）， 加入结合液后，向其中再加入1/3体积的异丙醇，然后按操作说明书操作。
2、溶胶一定要非常仔细，并且彻底！
3、溶胶以后，注意体系的pH值，如果pH值太高，也会影响回收。

如果你急着做，多做几个pcr分别回收，加起来就够了。
你跑过胶吗，你的产物看起来如何？

跑过胶，条带正确，但是亮度不高，也就是说浓度不高。我PCR过四管，也不行。

Try to run low melting temperature agarose gel and extract the PCR fragments from the gel with ddH2O saturated phenol only, and clean the DNA with phenol/chloroform， and ethanol precipitation in the presence of glycogen.

PCR结束了，试试直接做酶切呗，再跑电泳，做胶回收，回收的片段只要有（<10ng/ul都没关系），就可以做连接的。
or 过一个中间载体。

大量的做切胶回收，回收后，用乙醇沉淀，浓缩一下

特异性较好，可直接用PCR清洁试剂盒纯化下直接酶切，不需要再做胶回收了。AXYGEN爱思进PCR清洁试剂盒可以做到。

十几ng/ul可以接着做，没问题，你至少有30ul吧，那就四五百ng，酶切产物回收一次就算再损失一半也够的，我最低连接试过1ng/ul，可以连上的，不用疯 =D

我平时做回收时
有时即使浓度是低到快0了
拿来直接做T4连接 也是可以的
lz10几ng了 这个浓度 绝对是可以做连接的呀

你只是需要最后得到连接产物
不需要纯化得多完美 浓度多高
没有意义
你想想0.0001ng/uL 2ul里就有0.0002ng 片段
折算成mol量 和片段数
也是可以做连接的

1、如果试剂盒没问题的话，考虑一下片段大小。如果太小的话（500bp或以下）， 加入结合液后，向其中再加入1/3体积的异丙醇，然后按操作说明书操作。
2、溶胶一定要非常仔细，并且彻底！
3、溶胶以后，注意体系的pH值，如果pH值太高，也会影响回收。