经过BCA定量后，WB时内参依然不齐，而且异常诡异，**指点

小弟刚开始做WB实验 具体步骤如下

首先样品是前面师兄冻存在负八十里的，

分 正常组，模型组，给药组 三组动物组织

每次蛋白分装定量取20微克组织+200微升 RIPA+PMSF 剪刀尽量剪碎后超声，冰上15min后离心，紧接着BCA定量

分装时每管20微升的体系 蛋白量30~60微克，其余用LB和pbs补齐

所有操作都是尽可能的低温 离心管离心机提前预冷

 

下面是重点

 

所有的内参tubulin 全部都是 加药组深 模型组其次 正常组最浅

提了三次蛋白了 做了8块胶了 几乎都是一毛一样的趋势 就不发多张图了

 

 

虽然tubulin这么不齐 但是目的蛋白齐啊

本该是给药组最深的目的蛋白 在正常组tubulin非常浅的情况下 硬生生的和目的蛋白一个水平了

另外一个目的蛋白正常组也没表现出和tubulin相似的 该有的少量

 

各位大神帮忙看看 小弟现在真是不知道怎么办了

1.蛋白不要20ul来分装，每次用完放回-80，下次解冻继续用，一般短期内反复做不影响；

2.没有做过tubulin内参，有人说GAPDH做内参比较稳定，可以试试；

3.蛋白与loading buffer沸水浴5min，-80度冻存再次解冻后可能管底会有沉淀，上样时尽量不要洗到沉淀；

4.蛋白前期处理不清楚，我是裂解液裂解后用超声20hz超5s，三次，可以打断DNA降低蛋白粘度，

5.不知道你这个蛋白保存了多久，可以重新提一批蛋白试一下，

。。

求帮助- -

求帮助

Tubulins are the major components of microtubules, the major transport network in cells.  The microtubules are involved in a wide variety of cellular activities ranging from mitosis and transport events to cell movement and the maintenance of cell shape. Highly and stably expressed and conserved across the species, tubulins make excellent whole cell or cytoplasmic fraction loading controls in Western blotting. However, tubulin expression may vary according to resistance to antimicrobial and antimitotic drugs.

有可能加药后使tubulin得表达量发生改变

 谢谢 但是之前在有其他人做过我这个组织的wb tub都没什么问题的 我是不是可以考虑用灰度来调整上样

如果确定不是其他的什么原因，可以考虑用灰度来调整上样

1.蛋白不要20ul来分装，每次用完放回-80，下次解冻继续用，一般短期内反复做不影响；

2.没有做过tubulin内参，有人说GAPDH做内参比较稳定，可以试试；

3.蛋白与loading buffer沸水浴5min，-80度冻存再次解冻后可能管底会有沉淀，上样时尽量不要洗到沉淀；

4.蛋白前期处理不清楚，我是裂解液裂解后用超声20hz超5s，三次，可以打断DNA降低蛋白粘度，

5.不知道你这个蛋白保存了多久，可以重新提一批蛋白试一下，

为啥不用gapdh呢？

好像用不了 涉及氧化应激的