在做生物实验时，分离和提纯是经常要遇到的操作步骤。那么，分离与提纯的区别是什么呢？分离与提纯的方法有哪些？有机物的分离提纯和蛋白质的分离提纯方法，求赐教~
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蛋白质分离提纯方法主要有四种： 1、根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质。 2、根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐。 有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。 萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。 反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。 3、根据电荷不同进行分离纯化 根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。 在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。有研究聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。 离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 4、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛。 在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。
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分离提纯是指将混合物中的杂质分离出来以此提高其纯度。分离提纯作为一种重要的化学方法，不仅在化学研究中具有重要作用，在化工生产中也同样具有十分重要的作用。不少重要的化学研究与化工生产，都是以分离提纯为主体的。如石油工业等。分离提纯的方法不拘泥于物理变化还是化学变化。在可能的条件下使样品中的杂质或使样品中各种成分分离开来的变化都可以使用。常用的分离提纯的方法有以下几种:1.分级结晶法。这种方法常用加热蒸发溶液，控制溶液的密度，使其中一部分溶质结晶析出。经反复的操作可以达到分离提纯的目的。2.分步沉淀法。这种方法常选用适宜的试剂或调节pH，使溶液中的某一部分沉淀析出。经反复的操作，也可达到分离提纯的目的。3.选择性氧化还原法。用适宜的氧化剂或还原剂，使混合物中的某些成分氧化或还原，并进一步达到分离提纯的目的。4.吸收、吸附法。用适宜的试剂吸收混合物中的某些成分，例如用烧碱吸收混合气体中的二氧化碳。或者用适宜的物质吸附混合物中有的某些成分，如用活性炭吸附某些气体，从而达到分离提纯的目的。5.液液溶剂萃取法。选用适宜的溶剂，把混合物中的某些成分溶解吸收，从而达到分离提纯的目的。6.蒸馏法。控制混合溶液蒸气的冷凝温度，使不同沸点的成分分步冷凝析出，从而达到分离提纯的目的。
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一、分离提纯的基本原则 把物质中混有的杂质除去而获得纯净物叫提纯;将相互混在一起的不同物质彼此分开而得到相应组分的各纯净物叫分离。在解答物质分离提纯试题时,选择试剂和实验操作方法应遵循三个原则: 1. 不能引入新的杂质。即分离提纯后的物质应是纯净物,不能有其他物质混入其中。 2. 分离提纯后的物质状态不变。 3. 实验过程和操作方法简单易行。即选择分离提纯方法应遵循先物理后化学,先简单后复杂的原则。 二、分离提纯方法的选择思路 分离提纯方法的选择思路是根据分离提纯物的性质和状态来定的。具体如下: 1. 分离提纯物是固体(从简单到复杂方法) :加热(灼烧、升华、热分解) ,溶解,过滤(洗涤沉淀) ,蒸发,结晶(重结晶) ,电精炼。 2. 分离提纯物是液体(从简单到复杂方法) :分液,萃取,蒸馏。 3. 分离提纯物是胶体:盐析或渗析。 4. 分离提纯物是气体:洗气。 说明: (1) 蒸发与结晶 蒸发与结晶方法都可以将溶液中溶质以固体形式析出,具体采用何种方法,取决于溶质的性质和溶质的溶解度。 ①溶质的溶解度:蒸发一方面由于溶剂的减少,析出溶质,另一方面由于溶液温度的升高再溶解溶质,要使蒸发过程析出较多固体溶质,溶质的溶解度随温度升高应变化不大或减少,所以将溶液蒸发提纯出的固体是溶解度随温度升高变化不大或减少的物质。结晶(一般指降温结晶) 要析出较多的固体,溶质的溶解 度随着温度升高增加很快,这样才有可能从不饱和的热溶液降到低温时,析出固体,故将溶液降温结晶提纯出的固体是溶解度随温度升高增加很快的物质。例如NaCl 和NaOH 混合溶液,如果将混合溶液蒸发一段时间,析出的 固体是NaCl ,母液中是NaOH 和少量NaCl 。如果将混合溶液降温,使溶质以晶体析出,则析出的固体是NaOH ,母液中是NaCl 和少量NaOH。 ②溶质的性质: 蒸发过程,溶液的温度升高,溶液中溶质可能要发生反应变质,下列二种情况不能用蒸发方法,应选择结晶方法。 其一:溶质在受热时易分解。 如AgNO3 、Ca (HCO3) 2 、KMnO4 等,当然, 若能使水的蒸发温度低于溶质的分解温度,还可以用蒸发方法的,像NaHCO3 溶液在低温低压下蒸干,得到的是固体NaHCO3 。 其二: 盐水解产物中有挥发性的酸生成的。 如FeCl3 、AlCl3 、Cu (NO3) 2 等溶液,在蒸发时,因HCl 、HNO3 的挥发,促进了盐的水解,最后得到的固体是水解产物的分解产物Fe2O3 、Al2O3 、CuO。像Al2 ( SO4 ) 3 、NaAlO2 、Na2CO3等盐溶液,虽然也发生水解,产物中 Al (OH) 3 、H2SO4 、NaHCO3 、NaOH 都不是挥发性物质,在蒸发时,抑制了盐的水解,最后得到的是溶质不变的固体。 (2) 萃取与蒸馏 萃取与蒸馏是用于互溶液体混合物的分离提纯方法。如果在互溶液体中加入一种试剂(萃取剂,通常是水或物质的水溶液) 能将其转化为不互溶分层的液体,就用萃取法;如果 不能将其转化为不互溶分层的液体,那就用蒸馏法。为了能更好地分离和提纯,往往在蒸馏之前加入一种试剂,使其中一些物质转化为非 挥发性的盐
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