刚刚入行生物发酵这个行业，很多知识都在自己慢慢学习，最近经常碰到一些概念上的小问题不大好意思问同事和领导……哎，希望在这个坛子里能有好心的前辈替我指点一二。接下来，我要开始发问啦，大家不要笑话我啊！求帮忙回复解答。
什么是重组蛋白？重组蛋白的作用？重组蛋白如何制备？重组蛋白的提取纯化的步骤是怎样的？
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以大肠杆菌为例介绍一下重组蛋白质的提取步骤。(1) 大肠杆菌的酶解：1) 4℃ 、1000g离心15 min收集细菌细胞，倒去上清液，将湿细菌称重。2) 每克细菌细胞中加入约3 ml溶菌酶缓冲液（50mmol/L Tris·HCl，pH 8. 0；lmmol/L EDTA；50mmo1/L NaCl; lmmol/L PMSF)，涡旋，使菌体完全悬浮，加入溶菌酶，终浓度至0. 3mg/ml，于4℃搅拌30min。3）搅拌下加入脱氧胆酸盐，终浓度至1 mg/ml。4）加入核酸酶，终浓度至10mg/ml，搅拌下室温作用15 min。5) 4℃、10000g离心15 min，分别收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE，确定目标蛋白质存在于哪个组分中，如果目标蛋白质位于沉淀中，则重组蛋白是以包涵体的形式存在。(2）包涵体的清洗：1) 将破菌后的沉淀重悬于适当的缓冲液中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。2）将上述沉淀重悬于1％的Triton X-100中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。3) 将上述沉淀重悬于4mol/L的尿素或盐酸肌中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。4）将破菌后的沉淀重悬于适当的缓冲液中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。根据清洗的情况，可以适当地增加2)、3)步的洗涤次数。(3) 从包涵体中溶解重组蛋白：在溶解包涵体时，可以选用2％的SDS、8mol/L的尿素或8mol/L的盐酸肌等裂解液，根据蛋白质的特性、实验的要求进行选择，并进行优化。下面以8 mol/L盐酸肌为例，溶解包涵体中的重组蛋白质。1）用裂解液（50mmo1/L Tris·HCl, pH 8.0, 8mo1/L盐酸胍，1mmol/L DTT）重悬清洗后的包涵体，如果重悬困难，可适当地进行超声处理，然后在室温下作用lh，并不时地涡旋混合。2) 4℃、20000g离心30min，除去不溶性物质，保留上清。
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对楼上进行补充。提取方法： 一．固液萃取 在固液萃取中，提取物是由固相转为液相，或由细胞内转为细胞外，其提取效率与物质的扩散作用有关。 为了增加扩散物质的量，也就是提高提取速度，常采用如下措施： 1）提高材料的破碎程度，以增加扩散面积，减少扩散距离； 2）进行搅拌，使已扩散的溶质迅速与溶剂混匀，以保持两项界面最大浓度差，或分多次提取，不断更换新鲜溶剂，以提高扩散速率； 3）延长提取时间，提高提取温度，以及减少溶液粘度（如属大分子核酸干扰，加入少量鱼精蛋白或硫酸链霉素沉淀除去）等。 实际上从破碎后的固体细胞提取所需组分，当细胞破碎程度及提取温度受到限制时，采用少量多次提取方法较为有利。 二．液液萃取液液萃取选用的溶剂必须与被抽提的溶液互不混合、且对被抽提的溶质有选择性的溶解能力。最常用的液液萃取溶剂为二相溶剂，水或水-醇为一相，与水互不相溶的各种碳氢化合物，如低级醚、酯、苯酚等，为另外一相。
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提取一些具有生理活性的物质时，除了考虑被提取物溶解度外，还应考虑被提取物活性的保护。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说，主要措施有如下几点；1．采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离，造成溶液中PH值变化幅度过大，导致某些活性物质的变性、或由于PH变化影响提取的效果。在生化制备中，提取中常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等。 [缓冲液] 分为非-双性离子缓冲化合物类和双性离子缓冲化合物类。前者包括HCl-KCl、甘氨酸-HCl、乌头酸盐-NaOH、柠檬酸盐-磷酸盐、柠檬酸盐-NAOH、醋酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐-NAOH、磷酸盐、TRIS-HCL、硼酸-硼砂、甘氨酸-NAOH、碳酸盐-碳酸氢盐等，存在反应性和缓冲能力有限等缺点。双性离子缓冲液虽然具有很多优点，但依然存在反应性与不适应性的问题，如HEPEs是氨基丁酸的拮抗性（反应性）、不适应于所有的组织培养（不适应性）。 2．加入保护剂 防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的巯基，是许多活性物质和酶催化的活性基团，极易被氧化，故提取时常加入一些还原剂。一些易受重金属离子抑制生理活性的物质，加入某些金属螯合剂，把有害金属离子螯和掉，而保持被提取物的活性。 [螯合剂和巯基试剂] 巯基试剂在生化反应中有两个用途，一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反应中维持体系的还原环境。经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物（如二硫苏糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE）和2-巯基乙醇，谷胱甘肽也经常应用。一般来说二硫丁醇类是常选用的巯基试剂，不仅是因为挥发性低，难闻的气味较少，而且氧化电位低，比2-巯基乙醇浓度低很多的情况下，可以使其他二硫化合物完全还原。螯合剂用于控制反应中金属离子浓度或去除金属离子，常用的螯合剂有EDTA（乙二胺四乙酸）、EGTA、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸等。 3．抑制水解酶的破坏 根据不同水解酶的性质采用不同方法。如需要金属离子激活的水解酶，常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液除去溶液中的某些金属离子，使酶的活性受到抑制；对热不稳定的水解酶，可以用热提取法使之失去作用；或选用PH范围，使酶活性最低；还可针对性地加入某些抑制剂，以抑制水解酶的活性，但此类方法在蛋白提取中应用较少。 4．其它一些特殊要求的保护措施 除避免紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等情况外，有些蛋白质在提取时还有特殊要求，如固氮酶钼-铁蛋白，必须在无氧条件下进行。
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