【原创】miRNA茎环法（stem-loop）引物设计及软件分享

之前写过一个小软件，辅助设计miRNA荧光定量PCR茎环引物，现在拿出来跟大家分享一下。
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3'
pcr通用下游引物: 5' CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3'输入hsa-mir-224序列及茎环序列，茎环尾加长度一般为7或8，点击确定，如下图所示：
下一步设计PCR上游引物，我利用的是primer 3.0在线引物设计软件，网址为：http://primer3.ut.ee/
将模板序列的第一条序列、miR-224浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示

需要注意的是，上游引物与尾加序列重叠长度不能超过2个碱基，以防止上游引物直接跟残留的逆转录引物结合并扩增
修改参数：


点击“Pick Primers”按钮

提示上游引物Tm太低，我们可以在引物5'端增加GC含量来增加Tm，如下图所示增加四个g，增加gc时以不产生发卡结构为准

然后点击“Pick Primers”按钮

这样上游引物就可以使用了， 即：ggggCAAGTCACTAGTGGTT
附件是上面提到的小软件，欢迎下载，该软件免费、免安装

• primer.zip(213.92k)

楼主，刚设计遇到麻烦，miR引物序列为：GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG ；由于GC含量太高，无法使Tm值降至60左右，加AT好像要加很多很多，有没有更好的办法？

楼主您好：

1、谢谢楼主能做设计出这么好的软件来

2、新人学习 ，我不太明白您的反转录特异引物是在某篇文献中找的，还是。。。因为我从别的文献中看到过其他的特异性引物。。

3、特异性引物是什么动物都可以用么？？还是 每种动物都有不同的特异性引物？我做的是小鼠骨骼肌的MIRNA

好东西

正需要这样的资料

刚需，谢谢！

试着用楼主的软件用了一下，很有用。只是还有些问题（因为是新手，所以有些问题没有办法处理）：
1、引物5'端增加GC含量来增加Tm，但加了6个G才出现合适的TM值？最多可以加多少？
2、WARNING: Left primer is unacceptable: Unacceptable GC content/Long poly-X，该怎么处理？
3、有的引物Tm too HIGH，该怎么处理？
望指导！谢谢！

1、最多可以无限加
2、有时候受限于miR的序列无法设计成完美的引物，可以直接取miR序列做引物即可，不过要去掉外部与逆转录引物互补的7个碱基序列
3、加AT

楼主你好！你这个帖子的茎环序列，我在你其他帖子中也看到了，想必你们实验室用该序列效果是挺好的了。请问你用该茎环做的是什么物种？

人，其它物种也可以使用，与物种无关

好东西，谢谢