【分享】色谱柱反冲的那些事儿！

衣服穿久了要洗，色谱柱用久了要冲，不过冲洗色谱柱可不像洗衣服那么简单，到底该怎么洗，还是有些门道的：

第一个问题：用什么冲

1.1：什么叫冲洗色谱柱

通常，色谱柱冲洗就是把色谱柱上的脏东西和对色谱柱有损坏的东西冲出来，并且保存在合适的溶剂中；还有另一种情况，也可以算作冲洗的范畴，就是梯度方法间重新平衡色谱柱的过程。

1.2：常用的溶剂

针对于反相色谱柱，通常是用到纯的水和有机溶剂，水主要是作为冲洗掉色谱柱中的盐和其他添加剂，而有机溶剂则是用来冲洗掉一些在色谱柱上有较强保留的污染物，除了在分析中常用到的甲醇和乙腈之外，还有一些对污染物去除能力更强的有机溶剂也可以使用，比如异丙醇。

第二个问题：冲多久

色谱柱到底要冲多久，这个是经常困扰大家的问题，20分钟，30分钟，还是一个小时？

2.1.1：色谱柱冲洗的计算原理

其实，冲洗色谱柱并不是一个时间概念，而是一个体积的问题：通常要完全置换色谱柱中的流动相，需要至少十倍柱体积，也就是说，要有至少十倍于色谱柱体积的溶剂流过色谱柱才能把里面原有的溶剂彻底置换。

2.1.2：色谱柱体积的计算

色谱柱的柱体积就是色谱柱的圆柱型体积乘以色谱柱柱填料的孔隙率（一般约为0.6），所以算下来，一根常用的4.6×150mm的色谱柱柱体积大约是1.5mL，如果是10倍柱体积的量，就是15mL，按照常用的1mL/min的流速，就是15min的时间。

2.2.1：梯度重新平衡的冲洗时间

不过，这仅仅是置换所有溶剂的时间，其实仅仅是适合于短期冲洗色谱柱，比如梯度方法间的平衡时间，但是这还要受到仪器延迟体积的影响，已经流动相是否容易重新达到化学平衡的考虑，通常仪器的延迟体积越大，这个时间要越长，如果所使用的流动相不容易达到化学平衡，还要加长时间，比如使用使用某些缓冲盐的情况。当然也后很多情况下，梯度方法间的平衡时间是不需要这么长的。

2.2.2：清洁色谱柱的冲洗时间

如果需要彻底冲洗色谱柱，还需要更长的时间，通常建议是20倍的柱体积，也就是说，对于4.6×150mm的色谱柱，要冲30分钟才能保证冲洗完全。其他规格的色谱柱可以根据色谱柱的规格和流速进行简单的计算。

第三个问题：怎么冲

色谱柱的冲洗，无非两个情况：正常情况下的冲洗和非正常情况下的冲洗

3.1：正常情况下色谱柱的冲洗步骤

3.1.1：使用不含添加剂流动相后的冲洗

正常情况下，仅仅是对色谱柱进行流动相替换和净化，对于一般的方法，只需在方法结束后使用高比例的有机相比如甲醇或者乙腈冲洗色谱柱大约20倍柱体积即可。

3.1.2：使用含盐或添加剂后的冲洗

如果是使用的到的方法的流动相中含有缓冲盐或者其他添加剂的时候，先要使用和方法流动相起始比例相同的纯水相替代缓冲盐一相，冲洗20倍柱体积之后，再换上高比例有机相冲洗20倍柱体积。

3.1.3：色谱柱冲洗后的保存

对于色谱柱的保存，一般是存放在纯的有机相中，短期存放，甲醇乙腈均可，长期存放，建议储存在甲醇中。

3.2：非正常状况下的冲洗

如果是非正常的状况，就要考虑一些不走寻常路的冲洗办法了：

什么叫做非正常状况？常见的有两种，柱效下降和堵塞：

3.2.1：柱效下降色谱柱的冲洗

对于柱效下降，我们首先要确定是色谱柱的问题而不是由于仪器或分析方法造成的，排除这两者，如果不是色谱柱损坏比如塌陷（物理冲击造成），键合相水解（高温低pH下长时间使用），硅胶基质水解（高pH下使用）等不可逆损伤造成的柱效下降，因为排除上述问题外，多数情况都是因为色谱柱不太正常的“脏”了，可以首先使用纯的甲醇或乙腈长时间冲洗色谱柱，如果还不能奏效，可以考虑使用纯的异丙醇冲洗色谱柱，异丙醇的洗脱能力比甲醇乙腈更强，能把很多这两种溶剂无法冲洗的污染物从色谱柱上洗脱下来。如果效果仍旧不明显，可以参考色谱柱说明书中的“色谱柱再生”一项里面的说法，使用更加强大的溶剂冲洗，不过这些溶剂通常不是常用的反相液相色谱溶剂。

3.2.2：堵塞色谱柱的冲洗

如果是遇到堵塞的情况，首先要确定堵塞是由于什么原因引起的，如果是由于色谱柱中残留的缓冲盐引起的，这是最万幸的堵塞了，可以尝试用高比例的水相（推荐95%）在较高的温度下冲洗色谱柱。

如果是由于样品原因导致色谱柱堵塞，又要考虑另外的办法，如果是样品中含有太多吸附性很强的物质（有时是复杂样品中的某些杂质，无法通过过滤离心等办法去除）沉积吸附在柱头导致堵塞，可以尝试使用不同的溶剂（对此类物质有较好溶解性的）慢慢冲洗。

如果是由于样品过滤不当或者样品在色谱柱上析出导致某些颗粒杂质堵塞了色谱柱，除了尝试寻找合适溶剂冲洗之外，只能考虑反冲了，通常，不建议反冲色谱柱，因为可能对色谱柱造成较大损害，所以反冲是迫不得已的死马当活马医的办法，一定要慎用。做好样品的前处理并使用预柱或在线过滤器才是保护色谱柱的好办法！

3.3：快速冲洗色谱柱

看上去很好很强大的说法，其实很简单，在冲洗色谱柱的时候，可以通过增加流速来缩短冲洗时间，我们已经知道色谱柱冲洗的完全程度是通过体积衡量的，所以提高流速是可以节省下时间的。但是要特别注意的是，对于堵塞的色谱柱，提高流速可能并不是个很可行的办法...

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