【交流】芽孢杆菌表达系统---表达系统之新星：欢迎讨论和提问！[从事芽孢杆菌研究的朋友请报个到：）]

[注]：希望从事芽孢杆菌研究的朋友能够在此报个到啊！最好能自我介绍一下！:P

本人水平有限，本讨论旨在相互学习，相互交流。大家多发表一些见解，我的研究偏重于应用，不是非常深入，还请多多指教！如有对芽孢杆菌系统感兴趣的朋友或正在做芽孢杆菌的，欢迎一起讨论！！！
我想下面大致分为以下几大块：
1、芽孢杆菌的简要介绍
2、芽孢杆菌表达系统发展简史
3、芽孢杆菌表达系统的优点-----相对于大肠杆菌
4、芽孢杆菌常用的宿主和载体，包括近年来新兴的Brevibacillus brevis
5、芽孢杆菌表达系统几个成功应用实例（中国，日本，加拿大）[/

谢谢Dr. spore! 遇到芽胞杆菌的Dr.了,以后还要多多向你请教.
其实我博士已经毕业,我做芽胞杆菌纯属半路出家---只因为感兴趣.这个研究内容是我申报的一个广州市科技攻关项目.当时因为对芽胞杆菌不是太了解,为了获得资助,就尽找好听的写申报书,现在批下来了才发现有好多技术问题.下面是我当时项目的设计思路:
利用整合载体或自杀性质粒构建一株营养缺陷型纳豆芽胞杆菌,我现在选择的目的基因是thyA基因.然后将来源于其它亲缘关系较远的细菌的thyA基因克隆至一质粒载体上,从而构成一"载体-宿主平衡致死系统".若能构建成功将有两大好处:一是通过该平衡致死系统保证重组质粒的稳定性,二是将有用的异源基因插入质粒表达载体上以增加目的基因的拷贝数,从而提高表达产量.
我现在已有能在芽胞杆菌复制的质粒表达载体和用于芽胞杆菌基因敲除的整合载体,目前正建立纳豆芽胞杆菌的电转化体系.
我还有一个问题就是:某些芽胞杆菌本身就有一些质粒存在,若用来源其它野生型菌株的质粒构建表达载体时,宿主的限制修饰系统是否不酶切该质粒?

芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。

A.芽孢杆菌的分类
除枯草杆菌外，已报导用作宿主表达克隆基因的有：嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。
B.枯草芽孢杆菌168的基因组序列测定已完成

芽孢杆菌表达系统是在70年代从枯草芽孢杆菌，又称枯草杆菌（Bacillus subtilis）开始，逐步扩展至其它种的。
枯草杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达系统是与其早期的遗传学工作密切相关的。Spizizen于1958年发现枯草杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌的遗传学工作不断深入和发展。美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心（BGSC，http://www.bgsc.org）至1999年保藏的168菌株的遗传突变株就有890个。它牵涉到了诸多营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma因子、DNA重组与修复以及正负调控等各方面基因的突变体。70年代发明了DNA重组技术以后，特别是发现金黄色葡萄球菌的带有抗性标志的质粒可作为枯草杆菌的载体以后，克服了枯草杆菌只有隐秘性质粒的困难，枯草杆菌基因工程的工作更是加速发展。迄今，已经在枯草杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩。
将携有外源基因载体导入宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。大肠杆菌（G-）的氯化钙转化法对枯草杆菌无效，所以枯草杆菌基因工程表达系统中的宿主菌株用的最广泛的就是在DNA重组技术发明之前就可以进行感受态转化（Spizizen 1958）的168菌株及其突变体。Spizizen感受态转化的基本原理：是细胞在Spizizen最低盐培养基中形成一段饥饿、易于摄取外源DNA片段的时期。一般步骤是先将其在较为丰富的培养基中培养，然后转接到贫瘠的培养基中，使其形成感受态（一般非常短暂）。有关感受态时期参与摄取外源DNA的几种蛋白及其摄取机制已有初步的研究。[/

1、非致病性：除个别种（炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌）外对人畜无害。
2、转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA。
3、质粒和噬菌体都可以作为克隆的载体。
4、细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷璧质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。
5、能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。例如：α淀粉酶、蛋白酶及杀虫晶体蛋白等。
6、良好的发酵基础和生产技术，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。

（A）革兰氏阴性（大肠杆菌）和阳性菌（芽孢杆菌）细胞壁结构比较

粗略结构演示：

精细结构比较：


芽孢杆菌的简单的细胞壁结构赋予了它高效地向胞外分泌目的蛋白的能力,这样从而使得目的蛋白的纯化相对比较简单。
芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统（参考文献：Tjalsma H, Bolhuis A, Jongbloed JDH, Bron S, Dijl JM (2000) Signal Peptide-Dependent Protein Transport in Bacillus subtilis: a Genome-Based Survey of the Secretome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 515–547.），利用好这些有用的元件，就可以完成目的蛋白的高效分泌表达（在后面的例子中将举证），从而避免讨厌的包涵体的形成！

（B）生物安全性要求我们的宿主菌最好具有非致病性。而绝大多数芽孢杆菌恰恰能满足这一要求，而且还具备了一些其他菌株所没有的优良特性。事实表明，芽孢杆菌可以作为一些原核生物、真核生物和哺乳动物等的外源蛋白的表达宿主。有的已经大规模投入生产。。。

XXXXX------芽孢杆菌基因表达的主要特点----XXXXXX
:lol:
1、对数生长期后进入芽孢形成期，不同的芽孢形成阶段所表达的基因不尽相同。

2、多Sigma因子：RNA聚合酶全酶由5个亚基（α 2 β β’ ）组成。 σ因子的主要功能是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后就不起作用了。芽孢杆菌中已发现的σ因子有7种，而大肠杆菌只有2种。因而，大多数阴性菌的基因不能够在芽孢杆菌中直接表达而需要更换启动子等元件。

3、核糖体结合为点（RBS）：枯草杆菌最典型的SD序列是“GGAGG”，而大肠杆菌的为“AAGGA”。

4、大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，而芽孢杆菌只有一层细胞膜，因而可以大量分泌蛋白至培养基中。通过计算机分析，枯草杆菌有将近300个N端具有信号肽用来跨膜的蛋白。不过用来表达和分泌克隆基因的信号肽主要来自蛋白酶、淀粉酶和细胞壁表层蛋白等。

:D差点忘了：人无完人，菌也无完菌：芽孢杆菌也有它的缺点:D如下：
1、能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解。
2、能自发形成感受的的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低。
3、存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定。

:lol:虽然有这么多致命的缺点，但是科研工作者总会想办法去解决:lol:（看了最后的实例你就明白了！！！！！）

（A）呵呵，有一点重复，前面讲过一点宿主了：：枯草杆菌外，已报导用作宿主表达克隆基因的有嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等。总的来讲，人们选择以上种种不同种的芽孢杆菌作宿主，一般都有着极强的应用研究的目的，这一点，从这些菌株的名字上就可以看得出来。我们实验室现在也在自主开发一种野生的芽孢杆菌表达系统，一是看中了其高效分泌表达的能力；另外，对于菌剂产品来讲，将外源基因在芽孢杆菌中表达，可以大大延长产品的货架期。
（B）载体：目前，芽孢杆菌中常用的载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种。
从芽孢杆菌中分离的自主复制质粒，除极少数以外（例如pBC16），均为无抗性标志的隐秘质粒。带有抗性标志的自主复制质粒主要来自其它G+细菌，特别是来自金黄色葡萄球菌的质粒。其中广泛使用的有pUB110、pC194和pE194等。迄今，已在上述质粒的基础上构建了双标记质粒、芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭质粒、表达质粒、整合质粒和探针质粒等。绝大多数的载体在阳性菌中的拷贝数都非常低。
采用整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体，是克服芽孢杆菌质粒不稳定性的一个有效的途径。整合的目的一般通过同源重组或者转座子插入来实现。这种质粒的基本结构是在大肠杆菌质粒的基础上增加一个芽孢杆菌的抗性标志，以及待整合的目的基因。它在大肠杆菌中进行基因克隆或亚克隆操作。整合质粒导入芽孢杆菌后，由于它没有芽孢杆菌质粒的复制起点而不能自主复制，只有插入到宿主体后，随着细胞复制而复制。在含有整合质粒中芽孢杆菌抗性标志的抗生素的培养基上，就可以很容易挑出这种整合体。整合质粒另一个重要的用途是用于目的基因的敲除。
不少噬菌体都可用作载体，如Φ105噬菌体，SPβ噬菌体及其它噬菌体。其中 Φ105噬菌体应用较多，它是一个温和噬菌体，基因组约为39.2Kb，从中发展了不少载体。目的基因一般在体外“包装”之后，经噬菌体介导（转导）而进入宿主菌进行表达。

（C）Brevibacillus brevis（短短芽孢杆菌）：从我所阅读的文献来看，做得最早和做的最早的当属日本的 S Udaka。有兴趣的可以搜索一下他所发表的文章，四个字：比较狂多！他对短短芽孢杆菌进行了一些非常详尽的研究，同时也建立了几套高效的转化方法，形成了自己特有的高效表达系统（后面实例将详细述及）。日本人还把短短芽孢杆菌的可以介导外源蛋白高效分泌表达的信号元件申请了N多专利保护了起来。

概念划分：短芽孢杆菌属是近年来刚刚从芽孢杆菌属独立出来的一个新属，地位与芽孢杆菌属是相当的，形象地来讲：已经不再是芽孢杆菌属的下级了:lol:，短短芽孢杆菌自然也独立出来形成一个新种。

:P 短短芽孢 杆菌作为表达菌株的几个优点：1、几乎不向胞外分泌蛋白酶（枯草芽孢杆菌至少分泌8种不同的蛋白酶），利于目的蛋白的稳定性。2、细胞壁相对于枯草杆菌来讲更薄，有利于外源蛋白的分泌。3、据研究其发酵液中存在着可以促进蛋白中二硫键形成的因子，可以促进外源蛋白的折叠。等等。。。

1、中国（不知道大家知不知道？）
全球最大的EGF（表皮生长因子）供应商——中国百胜斯（总部上海）

首席专家烫懋竑教授：

百胜斯的产品：化妆品伊丽白露（女士的最爱:)）


百胜斯公司，是国内专业从事生物产品研究与开发的高科技公司，公司首席专家汤懋竑先生为中国科学院遗传研究所研究员，最终解决了EGF芽孢杆菌基因工程系统的蛋白酶多、不稳定等世界性技术难题，研究开发出了具有世界领先水平的“汤氏芽孢杆菌基因工程系统”。采用该系统，EGF获得了高效稳定表达，大大降低了生产成本，从而占领了世界生物技术领域中的一个新技术制高点，为环保、工业、农业、医药业下游产品的进一步开发奠定了基础。

***************国人的骄傲*********************

2、日本：文章很多，做得非常出色----短短芽孢杆菌表达系统

主要是运用了一段胞壁蛋白的信号序列来做表达，对各种表达瓶颈进行优化。
他们也是主要用于生产EGF（都看中了女人手里的Money）用于化妆品。
日本人的短短芽孢杆菌的表达系统精细图示：五个串联启动子，两个SD序列，还有信号肽序列+结构基因。实际上后面应该还有强Terminator以防止通读。


他们用本系统做过的蛋白：最高可达3.7g/L。





********短短芽孢杆菌分泌表达系统的国内研究******************
北京，军事医学科学院生物工程研究所，彭清忠，2002年
1、从土壤中分离到5株分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活　的短短芽孢杆菌。
2、PCR扩增了其胞壁蛋白的启动子和信号肽区，克隆到pUB110上构建穿梭分泌表达载体。
3、使淀粉酶以活性形式分泌表达，活力为出发菌株的2倍。
4、初步建立了短短芽孢杆菌的分泌表达系统。
:P不知为啥，2002年发了几篇核心期刊，随后就没有动静了。:P

:)我也在做一点这方面的工作

3、加拿大：Dr. Sui Lam Wong ，Associate Professor (加拿大卡加利大学 )

可以说是我们华人的骄傲！祖籍应该是香港，科研工作非常出色的前辈，发现了枯草芽孢杆菌的新的蛋白酶，分子伴侣研究等。据我所“读”，该前辈发表了N篇SCI。构建了敲除了8个蛋白酶基因的非常出色的枯草芽孢杆菌宿主菌WB800。
:cool:致谢:cool:Dr. Sui Lam Wong 对我的工作提供了极大地帮助，在此表示衷心感谢！！！另外，Bacillus Genetic Stock Center 的Dr. Daniel Zeigler也为我的工作提供了一些不可多得的材料，一并致谢！！！（感慨于老外的大公无私的资源共享精神！很多国人做不到这一点，种种原因。。。）:cool:

++++++++++++话题歪了，不好意思，转回来++++++++++++++
Dr. Sui Lam Wong 的研究方向和正在进行的内容：
RESEARCH INTERESTS
1、Regulation of gene expression.
2、Molecular chaperone assisted 　protein folding.
3、Extracellular proteases.

While the development and improvement of this microbial expression-secreted system are in progress, several medically important proteins including single-chain antibody, bacterial plasminogen activators (blood-clot dissolving agents) and interleukins are selected to evaluate this production system. Certain novel and desirable properties will be introduced into these molecules through genetic and protein engineering.

总之，随着研究的不断深入，枯草杆菌蛋白分泌机制将得到更清楚的了解，许多新的分泌元件和蛋白酶都会被认识。相信在不久的将来影响枯草杆菌表达系统发展的问题会很好地被解决。除了上述的内容,关于芽孢杆菌分泌表达系统尚有其他问题有待进一步研究。首先需更深入地探索其分泌机制,透彻了解蛋白转运及折叠过程,尤其是分泌限速因素,对基因工程菌株的构建工作有重要的指导作用。其次,应利用先进的发酵技术和蛋白的优化设计,补偿菌株自身的某些缺陷,提高目的蛋白的产率。另外,将各种改进策略有机地结合使用,应能更显著地提高外源蛋白的分泌效率。总之,近年来对在芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的研究取得了很大进展,建立了一系列有效的外源蛋白表达系统,尤其是B . subtilis 和B . brevis 表达系统,已在一些有价值的多肽生产上获得了成功 ,显示出良好的应用前景。

:lol:今后它还会向着不断完善和扩大芽孢杆菌宿主/载体表达系统，提供越来越多价廉物美的产品造福人类的方向前进。

:o据文献报道，已应用芽孢杆菌，但这些菌还不是基因工程菌的有以下领域：洗涤剂、食品工业、苎麻脱胶、纸浆、纺织、污水处理、原油降解、石油增产、除臭剂、浸提金属、利用秸秆产丙酮等、降解低密度乙烯塑料、角蛋白降解、几丁质降解、木材处理、降解木质素、生产高麦芽糖浆、酱油渣做鱼饲料、植物生长刺激物、草地、根结线虫的防治、抗真菌、控制小麦和其它作物的根瘤、增产菌、芽孢杆菌固氮、细胞壁表面蛋白、杀软体动物、耐热蛋白酶抑制剂质慢性肝炎、病毒病和艾滋病、抗肿瘤、降低酒后血液酒精浓度、抗高血脂等等。

#####:cool: 在以上的领域中，只要其中有少数领域应用芽孢杆菌基因工程和蛋白质工程技术对所用的芽孢杆菌进行实质性的提高，就将会产生相应的社会和经济效应。:cool:##############

******呵呵，有没有心动的呀？%%%%%%%%%

谢谢Jerry的提问，正好可以做一下补充：
1、芽孢杆菌的培养条件如何，生长速度怎么样？
芽孢杆菌中的枯草芽孢杆菌是仅次于大肠杆菌，在遗传上和生理、生化上研究较为详尽的一种原核生物。相对于大肠杆菌和其它的微生物来讲，枯草芽孢杆菌的培养条件相当粗放，a、生长速度非常快，在培养基中可以很快占取优势地位，可以防止杂菌的污染。b、营养要求较低，在简单的培养基中即可很好地生长和发酵，淀粉和纤维素（枯草的来历）都可以作为其成本低廉的培养基。c、生长温度要求不严格，在30-37度均可很好地生长，利于大规模发酵控制。
对于新兴的短短芽孢杆菌，从我的实验中的个人体会来讲，也是基本具备以上优点的。而且，芽孢杆菌有众多有特殊功能特性的属和种，比如利用嗜热脂肪芽孢杆菌来发酵可以解决发酵罐的高温制冷的巨大成本，利用嗜碱芽孢杆菌可以使我们的产品在沿海滩涂恶劣的环境中得以应用。呵呵，就怕我们想不到。。。

2.感受态持续时间短暂，分子克隆效率低，大概是多少？
这个短暂只是相对的，是相对于大肠杆菌讲的，大家都知道大肠杆菌的转化体系已经近乎完美，非常成熟。芽孢杆菌可以自发形成感受态，但是时间极短，培养时间不同或不同的培养批次都可能导致转化效率的急剧下降。当然，这就需要我们通过一些单因素或多因素实验来建立一个最优化的系统。
Biotechnology Techniques (1999) 13:337-340 ，有一篇关于不同种芽孢杆菌转化的简单的方法，非常简单。但是我没有重复出来！他可以做到 1000~100000转化子/ug质粒。对于建库来讲，已经足够了。况且，在作表达的时候，可能只要有一个转化子就足够了！
随着各种转化手段的发展：电穿孔、接合、转导和转染等等，转化效率已经不再是一个限制性因素。原生质体转化则从理论上来讲，所有菌株都应该可以被成功转化的，除非有限制/修饰系统。

3.怎么解决表达中大量的胞外蛋白酶？用Gene　Knockout的宿主菌？
这是困扰众多科研工作者的难题之一。现主要有几种方法：1、诱变的方法得到蛋白酶基因缺失突变株。2、基因敲除。3、筛选不分泌或极少分泌蛋白酶的菌株作为宿主。

4、如果是用gene　knockout的宿主菌，那用的是什么方法？
据我所知，Dr. Sui Lam Wong主要采用了两种方法：1、用具有抗生素抗性的同源重组载体进行基因敲除，势必引入了众多的抗生素的抗性，对于菌株的环境释放来讲，很难通过生物安全评估。WB800就是已经被引入了至少三种抗生素抗性的。2、利用自杀性同源重组载体敲除，不会引入抗性基因。
我想细菌的基因敲除和其他物种的原理应该会有相似之处。基因敲除确实会在一定程度上影响菌株的生理生化特性。WB800与原始菌株有一些不同，但是没有影响到它的一些主要性能和特性。

4、关于转化方法，我在枯草芽孢杆菌上主要采用感受态的方法，效率还可以，出了培养基成分稍微复杂之外，操作还蛮方便的。Tris-PEG的转化方法记得老教授的文献上讲：对于电转化未成功的菌株用Tris-PEG的转化方法实现了转化。个人也感觉这个Tris-PEG的转化方法比较麻烦，懒得用。现在我经常用电转化（Bio-Rad Pulser）来转化我的野生菌株，但是效果不是很好。其实电转化的条件参数非常重要，可能是我的参数没设置好的原因。而且有的时候得到的转化子竟然提不出质粒来，非常令人郁闷！如果野生菌株再存在个修饰/限制系统，那就更有的搞头了！！！◎

Originally posted by DrPrion at 2004-4-24 06:26 PM:
。有关表皮生长因子(EGF)。。。好像是86年的诺贝尔奖得主，一个stanford的牛人(记不清名字了)第一个提出来，现在美国，日本很多企业在做，利润不错，--全球最大的EGF（表皮生长因子）供应商——中国百胜斯？（搞不懂，自封的第一还是xx国际杂志的评比？），说老实话，这是我感觉spore的seminar的唯一瑕玷的地方（即使是第一，何不拿出一个比较权威的统计数据show us？）