对于RNA-seq，除了gene水平的差异分析外，还可以进行exon水平的差异分析。这时可以使用Bioconductor的DEXSeq软件包。
使用DEXSeq软件包，其输入为Count table。要生成这个Count table，与DESeq, edgeR类似的，都需要使用到htseq。DEXSeq提供了两个python角本，来调用htseq生成计数文件。
关于HTSeq的安装，请参考http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/install.html
对于DEXSeq的安装，直接使用source(“http://bioconductor.org/biocLite.R”);biocLite(“DEXSeq”)就可以了。
第一步：计数
安装结束以后，使用system.file(“python_scripts”, package=”DEXSeq”)来找到DEXSeq提供的python角本的路径。
1 | python ~/projects/RLib.3.01/DEXSeq/python_scripts/dexseq_prepare_annotation.py Homo_sapiens.GRCh37.75.fixed.gtf DEXSeq.hg19.gene.gff |
这里需要注意的是，gtf文件必须与mapping的基因组一致，尤其是染色体的名字要一致，比如说如果mapping时有chr，gtf文件中的染色体一定也需要有chr。这里运行python是在terminal中，而不是R中。
而后使用dexseq_count.py来计数。
1 | python ~/projectGREEN/RLib.3.01/DEXSeq/python_scripts/dexseq_count.py -p yes -s no -a 10 -f bam ~/DEXSeq/DEXSeq.hg19.gene.gff bam.file out.counts |
在这里，参数-p指出mapping文件是否是pair end文件。参数-s表示是否是stranded，默认为yes。-f指输入文件的格式，默认为sam。
在运行计数结束之后，需要检查一下最后四行，看看empty的多不多，如果超过20%，可能需要检查一下mapping的结果，当然也可能是计数文件准备错误，比如mapping结果没有index等等。如果以上都不是，那可能是polyA太多了。
第二步：读入数据
在R中读入计数数据，需要准备好计数文件，实验设计，以及前面用到的gff文件。在这里，我们使用Bioconductor中已有的pasilla数据来示例。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 | > suppressPackageStartupMessages(library("DEXSeq")) > inDir <- system.file("extdata", package="pasilla") > countFiles <- list.files(inDir, pattern="fb.txt$", full.names=TRUE) > gffFile <- list.files(inDir, pattern="gff$", full.names=TRUE) ##注意，如果是自己的数据的话，比如之前示例使用的是DEXSeq.hg19.gene.gff，这里就用DEXSeq.hg19.gene.gff > ##实验设计 > sampleTable <- data.frame(row.names=c(paste("treated", 1:3, sep=""), paste("untreated", 1:4, sep="")), + condition=rep(c("knockdown", "control"), c(3, 4))) > > dxd <- DEXSeqDataSetFromHTSeq( + countFiles, + sampleData=sampleTable, + design= ˜ sample + exon + condition:exon, + flattenedfile=gffFile) |
第三步：获得差异表达数据
只需要一步
1 2 | > dxr <- DEXSeq(dxd) > dxr |
但是，我们似乎并不太明白它在背后做了些什么。于是我们一步一步的来查看它是如何做的。
同DESeq一样，它分为三个步骤：normalization, Dispersion estimation 以及 testing for differential exon usage。
1 2 3 4 5 | > dxd <- estimateSizeFactors(dxd) #第一步 > dxd <- estimateDispersions(dxd) #第二步，此时可以使用plotDispEsts(dxd)来观察离散情况 > dxd <- testForDEU(dxd) #第三步 > dxd <- estimateExonFoldChanges(dxd, fitExptoVar="condition") > dxr1 <- DEXSeqResults(dxd) #可以使用plotMA(dxr1)来查看结果 |
在第二步中，我们可以重新设计formula以符合实验要求，当然第三步也要随之改变。
对于结果dxr，可以直接视为data.frame来操作。也可以使用as.data.frame来转换它。结合使用plotDEXSeq就可以查看自己感兴趣的目标基因中的exon的表达情况。
原文来自：http://pgfe.umassmed.edu/ou/archives/3690
