全自动固相萃取-比色法测定保健食品中总皂苷
作者：赵晓冬
目的：建立保健食品中总皂苷的含量测定方法。
方法：采用Sepline全自动固相萃取装置对保健食品中的总皂苷富集,通过70%乙醇回收，以香草醛-高氯酸为显色剂，采用比色法测定。
结果：比色法测定的线性范围为0.038～0.268mg，相关系数 r=0.9997; 在不同保健食品中的平均加样回收率均在98.3%～102.4%，RSD〈2.2% (n=6)。
结论：本法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于不同类型保健食品中总皂苷的含量测定。
目前保健食品中的总皂甙测定方法尚无国家标准，大多都是按照《保健食品检验与评价技术规范 (2003年版) 》“保健食品中总皂甙的测定”方法检测，该方法采用人参皂苷 Re为对照，用香草醛比色法测定总皂苷。其显色体系为:香草醛-冰醋酸-高氯酸，但在实际操作中和据相关文献报道中，但采用该方法检测结果误差较大，尤其是不同实验室间测定结果差异更大,不利于产品的质量控制。有文献报道，卫生部食品卫生监督所2000年组织全国22个省、市、自治区省级疾病预防控制中心对这一方法进行比对试验，结果显示:离散度较大，有的浓度水平还出现离群值，各实验室间的RSD达80%，因此需要对测定方法加以改进。本文采用莱伯泰科公司Sepline全自动固相萃取提取装置 具有洗脱液流速恒定可控、大批量产品自动化处理，保证试验系统的密闭性等优点可保证结果的平行性和准确性。在对大孔树脂进行品牌筛选的基础上，定制统一规格固相萃取柱、对总皂苷测定前处理过程进行了优化，整套方法简单，数据结果离散性小，平行性得到提高。
1材料与方法
1.1 仪器
UV-2450 紫外可见分光光度计(日本，岛津公司)，CP2250分析天平，AS10200ADT超声波清洗仪，TLL-DCⅡ型氮吹仪，Sepline全自动固相萃取系统（北京莱伯泰科有限公司），固相萃取柱（底层有砂芯隔板,内装XAD-2大孔树脂2.7g,Alumina-N中性氧化铝，6ml,北京莱伯泰科有限公司）。
1.2 试药
人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院，含量92.7%），冰醋酸、香草醛、高氯酸、乙醇均为分析纯，水为纯化水。
1.3 供试品
上普牌西洋参含片 (厦门上普药业有限公司，批号14040201)；天信减肥茶( 福建安溪馨隆保健品有限公司，批号: 20140504 ) ；辅助降血脂片（哈尔滨久盛医药科技开发有限公司，批号:20140714）珍迪牌黄芪阿胶口服液（南昌健民营养补品厂，批号: 20130701）
２方法与结果
2.1 标准溶液制备
精密称取20mg人参皂苷Re对照品置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取10mL人参皂苷Re标准溶液（0.2mg/ml）放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），准确加入10ml水溶解，作为标准溶液
2.2 样品溶液制备
精密称取适量样品，置于50mL容量瓶中，加水适量溶解，超声30min，放置至室温，用水稀释至刻度，摇匀， 3000r·min-1离心5min,0.45um微孔滤膜过滤。若为非乙醇类液体试样，先经0.45um微孔滤膜过滤，取精密过滤后样品1mL (根据试样含总皂苷量定) 进行固相萃取。
2.3 样品溶液吸附及洗脱
取样品溶液上清液置于收集管中（大于2ml）, 放置于Sepline全自动固相萃取系统中，按以下步骤进行吸附及洗脱（详见图1）。
2.3.1 活化：在固相萃取柱中，以2.5 ml·min-1 流速冲洗70%乙醇25ml、然后以2.5 ml·min-1 流速冲洗水25ml。
2.3.2 上样：以1ml·min-1 流速加1ml样品溶液于固相萃取柱中。
2.3.3 洗脱：以0.8ml·min-1 流速, 依次用25ml水，25ml70%乙醇进行洗脱，收集70%乙醇洗脱液,在收集结束时氮气吹扫管理残留洗脱液50s。
2.3.4 挥干：将收集的洗脱液转入50ml的离心管中，在60℃下氮气吹干。
在上述已挥干的洗脱液中准确加入0.2ml5%香草醛冰乙酸溶液，使残渣都溶解，再加0.8ml 高氯酸，混匀后60℃水浴上加热 10min，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸 5.0ml，摇匀后，以 1cm 比色池于 560nm 波长处与标准管一起进行比色测定。
2.5 线性关系考察
精密吸取“2.1”项标准溶液0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、、1.4人参皂苷Re标准溶液（0.2mg/ml），按 “2. 3”“2.4”项下方法进行前处理并测定。以吸光度值为横坐标， 以人参皂苷Re含量 (mg) 为纵坐标进行回归计算，回归方程为y =0.3521x+0.0018，r=0.9997，结果表明，总皂苷( 以人参皂苷Re计) 在0.038～0.268mg 范围内线性关系良好。
2.6 加样回收率试验
采用加样回收率法，精密称取4类保健品适量，分别按样品量的100%的比例各6份加入对照品 ，按“2.3”项下和“2.4”项下进行测定，并分别计算回收率(见表1-表5)，结果各品种平均加样回收率均在98.3%～102. 4% ，RSD＜2.2% ，并与传统方法（手填层析柱、人工进行柱洗脱）进行比较，表明该方法准确度良好，且离散度低于传统方法。
2.7 稳定性试验
将显色后样品分别放置 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h， 测定吸光值。结果表明该显色体系在1 h内吸光度基本不变，1h后吸光度有所降低，故在显色后1 h内测定。
2.8 样品含量测定
取4类保健食品 ，按“2.3”项下和“2.4”项下进行测定，于 560nm 波长处测定吸光度值， 根据所得到的标准曲线计算样品中总皂苷的含量(见表6) 。
表6 4类保健品中总皂苷测定结果
讨论
3. 1 《保健食品检验与评价技术规范(2003 年版) 》保健食品中总皂苷的测定,样品采用过大孔吸附树脂，再加显色剂显色后测定吸收值。在其操作过程中，但在柱层析时，树脂活化的时间长短以及样品在过柱时，洗脱速度快慢不一，使得测定的总皂苷结果误差较大，无法确保产品质量的检测稳定。采用莱伯泰科公司Sepline全自动固相萃取提取装置具有洗脱液流速恒定可控、树脂活化时间适当延长，大批量产品自动化处理，保证试验系统的密闭性等优点可保证结果的平行性和准确性。3.2不同厂家的大孔树脂、填料松紧和载药量也对总皂苷测定影响较大，在对大孔树脂进行品牌筛选的基础上，选择Sigma公司的XAD-2大孔树脂，莱伯泰科公司定制生产统一规格固相萃取柱，简化实验前处理过程，数据结果离散性小，平行性得到提高。
3.3 前处理方法的考察 本试验分析的保健品剂型有含片、胶囊 、口服液 、袋泡茶，由于样品状态不同，因此在上柱前的样品需经离心，并经微孔滤膜过滤，保证不阻塞固相萃取提取仪进样系统。
3.4 测定时间的选择 由于该反应是显色反应，测定时间的差异会导致测定结果极大的不同，因此应严格控制测定时间。样品从60℃水浴中取出后，立即用冰水浴冷却2min，精密加入冰醋酸5mL，摇匀进行测定，从而保证样品显色完全，提高检测结果的准确度。由于随着时间的推移，总皂苷的吸收值会逐渐减小，经考察显色后1 h内吸收值较稳定，因此应保证检测在1 h 内完成，从而减少检测误差。
