楼主 | 收藏 | 举报 2017-07-02 19:44   浏览:203   回复:0

腺相关病毒(AAV)在动物体内的应用研究

腺相关病毒属于微小病毒科 (parvovirus),为无包膜的单链线状 DNA 病毒,基因组大小约 4.7 kb。利用腺相关病毒可以将外源基因转入动物组织和细胞中,具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达稳定等多种优点,广泛应用于动物体内研究。


腺相关病毒血清型众多(12),不同血清型对不同组织亲和性不同。因此在具体科学研究中,以下问题往往困扰着广大科研工作者:选择何种血清型?如何注射?注射多少病毒?注射部位如何选择?注射多久检测?

本文就常见的注射部位(大脑、视网膜、肝脏、心脏和动脉、肺脏、肾脏、肌肉、肠)和方法做一个简单的归纳,为大家提供一个概念和思路。

一、大脑

大脑组织常用血清型有 AAV1,AAV2,AAV5,AAV8 和 AAV9,其中神经组织常见的血清型有 AAV2,AAV5 和 AAV8。对大脑组织而言,AAV5 应用范围更广,AAV8 更有效(值得注意的是,在猴子的神经组织中,AAV5 更有效)。从作用效果上看,AAV8 大于 AAV1。

针对大脑组织不同部位,AAV 不同血清型靶向性有所差异:

1)海马组织:AAV9 比 AAV8 更有效;

2)神经组织不同的细胞,不同血清型靶向性不同:如神经元常用的血清型有AAV1、AAV2、AAV5 和 AAV9;星形胶质细胞和少突胶质细胞常用的血清型有 AAV1 和 AAV5 。

总体而言,在所有组织中,AAV2 适用性广且在脑部组织也有所体现,例如其可以达到大脑组织 75% 的区域。AAV2、AAV5、AAV8 和 AAV9 也比较常见,应根据不同组织进一步慎重选择,在此介绍几种特例:

1、肠神经系统(Enteric Nervous System ENS),是由神经细胞组成的复杂网络,遍布整个肠胃消化管道。其神经元的数量和脊髓相当(约1亿个神经细胞)。该神经系统在人体躯干下部,属于迷走神经,以薄层的形式分布于消化肌之间,调节消化。常用 AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9 ,AAV6 对肠神经胶质和神经元有一定的靶向性。注射部位可以选择降结肠,注射量和滴度: 滴度为 1.3 × 10^12 GC/ml的病毒注射 5 μl 即可。检测时间:注射后 2 周开始表达,2-6 周均有检测。

2、脑组织常见的血清型为 AAV9,注射方法:左心室注射或者侧脑室注射。注射剂量和滴度:选择滴度为 0.5–4.0×10^11 GC/ml 的病毒液,稀释成 100 μl ,注射两周之后(14d) 开始检测。

二、视网膜

视网膜组织常用血清型有 AAV1、 AAV2 和 AAV5 。视网膜组织由于其特殊性,因而有自身的特点:注射成功率 20-30%,容易造成视网膜炎症和损伤,注射完需要使用 1% 阿托品(和少量新霉素、多粘菌素B硫酸盐和地塞米松眼膏施用于眼睛,延长瞳孔扩张时间,减少腺体分泌,减少炎症反应),连续使用 3-5 d 。其常用的注射量为 0.5 μl ,病毒滴度 1.5x10^7 GC/ml 。常用注射方法:视网膜下注射或者玻璃体注射。

但不同血清型又有不同特点:AAV1 主要作用于视网膜上皮细胞,注射后 2-4 周可以检测;AAV2 主要作用于感光细胞、视网膜上皮细胞和玻璃体,AAV2 玻璃体注射后分布广泛,2-4 周可以检测; AAV5 可作用于视网膜上皮细胞和感光细胞,在感光细胞中表达 AA5>AAV2,2-4 周检测。

三、肝脏

AAV2、AAV5、AAV7 和 AAV8,其中 AAV7 和 AAV8 的效率是 AAV2 的 10-100 倍。注射部位常选择门静脉、外周静脉和尾静脉。注射病毒滴度一般选择 8×10^10-2×10^12(GC/kg)(人、灵长类);1×10^11 GC/只鼠,稀释成 50-100 μl 进行尾静脉注射;注射 2 周之后可以检测。

对心脏和动脉而言,常用血清型有:AAV1、AAV6、AAV8 和 AAV9 。其中 AAV2、AAV5、AAV7 也可以使用,但是表达比较慢,3 个月后表达量才能与 AAV1、AAV6 表达量相当。所有血清型中 AAV8 和 AAV9 最有效,2 个月左右其表达量达到最高。

常见的注射部位为冠状动脉、主动脉、心肌和尾静脉。注射病毒滴度为 1.9×10^11-10^12 GC/ml,稀释成 100 μl- 250 μl(大鼠剂量稍高于小鼠)注射;但是对于心脏原点注射而言,常采用 10^10 GC/ml 病毒滴度,稀释成 20 μl 使用。检测时间:一般在2周之后可以检测。

四、肺脏

肺脏常用血清型有 AAV1、AAV2、AAV5、AAV6 和 AAV9。由于肺脏表面唾液酸受体分布比较多,因此 AAV5 型比较常用;相比之下 AAV2 和 AAV6 转导效率相当。常见的注射方式有滴鼻、雾化吸入或气管内注射,注射病毒滴度为 10^12 GC/ml ,稀释成 3 μl,注射完之后 2 周可以检测表达情况。

五、肾脏

肾脏常用血清型有 AAV2、AAV8 和 AAV9。注射病毒的滴度一般选择 1-5×10^11 GC/ml,稀释成 50-200 μl 注射。常见的注射部位有肾动脉、肾静脉和左髂脉、腹主动脉,注射完 2 周之后可以检测表达情况。

六、肌肉

肌肉组织常用血清型有 AAV2、AAV8 和 AAV9。其中 AAV8、AAV9 最常用,心肌、胰腺和肾上腺也是如此。骨骼肌分为快速和慢速肌纤维,AAV2 常作用于慢速肌纤维,AAV6 则对二者都有效。对不同年龄阶段的鼠,注射剂量有所不同:幼鼠选择的病毒量为 7×10^10-1.2×10^11 GC/g;成年鼠选择的病毒量为 3.5 ×10^11-7×10^12 GC/只;但是低剂量的 AAV9 不能到达所有心肌细胞。

七、肠

肠组织常用血清型有 AAV1、AAV2 和 AAV5。常见的注射方式有口服、灌肠、腹腔注射、肠系膜动脉注射。一般选择注射滴度 1×10^11 GC/ml ,稀释成 100 μl(PBS或者稀释液稀释)使用,注射 2 周后可以检测。

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