四种基因敲除动物模型技术的原理、特点及趋势

动物模型是现代生命科学研究的重要工具，特别是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着不可替代的作用。近几年来，制 备动物模型的基因修饰技术层出不穷，这不仅包括传统ES打靶、TALEN、CRISPR/Cas9，还有TetraOne基因敲除新技术。如此繁多的技术该如何选择？本文将对这四种技术的原理、特点、缺陷及未来发展趋势作系统的介绍和对比。

基于胚胎干细胞（ES）的同源重组技术俗称“传统的基因打靶技术”。因具有技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点而受到众多科学家一致好评，此外，世 界上所有重要的的基因敲除小鼠模型均通过此技术制备。尽管新兴核酸酶修饰技术如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等相继出现，但基于ES细胞的 同源重组技术依然是唯一可以满足所有基因组修饰要求的技术。

基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合进靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因打靶技术目前已 被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法，其中包括了多种不同的基因敲除和敲入系统，特别是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使 得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠。但其存在周期长的缺陷，通常制作周期10-12个月。

TALEN技术是一种新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关 系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序 列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，且具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。但因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行 小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。加上存在马赛克现象，所以在做基因敲入（KI）和其他应用时候也必须谨慎的进行检测。

CRISPR/Cas9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats） 是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性 免疫防御机制。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans- activatingRNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链 DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑，目前已经成功应用于大小鼠基因的 KO/KI模型制备，其原理也是对目的片段产生特异的切割后，修复过程中产生移码突变或者是片段缺失，或者是在切开位置产生片段插入等现象。

TetraOne基因敲除是业界推出的新技术，沿用ES细胞同源重组的技术体系，采用独特的建系和基因改造技术建立了具有遗传优势的TetraOne ES细胞系，通过胚胎发育前期的显微注射，使TetraOne ES细胞100%代替内源ES细胞，实现跨越“嵌合体”阶段从而快速获得去Neo杂合子小鼠的基因打靶专利技术。

TetraOne技术是基于ES细胞打靶技术的金标准，通过同源重组技术将外源基因定点整合进靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造基因组某一基因的目的。同时TetraOneTM技术还具有核酸酶技术周期短的优势，将传统ES打靶技术的周期缩短一半，并且不会像核酸酶技术那样带来脱靶效应和马赛克现象，在核酸酶技术尚未成熟之前，TetraOne技术将是研究者最佳的选择。