【求助】请高手鉴定并指点一下我的TRAP染色

各位园子里的大大们，本人小硕，刚刚开始做破骨细胞分化方面的研究，目前遇到一个问题，诱导出来的破骨细胞做TRAP染色颜色不对。本人用的是RAW264.7细胞，诱导4天，TRAP试剂盒是SIGMA的387A。这是诱导的图片，请各位大大帮帮忙，看看问题到底出在哪里？本人感激不尽。
第一张是没染色之前。200x

第二张是染色后 200x

这张是苏木素复染后的。

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syx117

沙发 | 回复 | 举报 2015-12-08 23:33

yugicheung
TRAP染色试剂没配正确，有两个试剂是提前2min混匀后再配的；或者是试剂失效了

.染色步骤
1.取6孔板，弃液，加PBS1ml/well清洗，弃PBS
2.4%多聚甲醛（37°左右）1ml/well加入6孔板，置于孵箱25min取出，加1ml/well PBS 清洗
3.1个1.5ml EP管，+fast garnet GBC base solution（氨偶氮卞） 0.5ml
+sodium Nitrite solution(亚硝酸盐) 0.5ml
二者轻轻混匀30秒，室温静置2min
4. 37°超纯水 45ml
步骤3的液体 1ml
Naphthol AS-BI phosphate solution（萘酚） 0.5ml
Acetate solution （醋酸） 2ml
Tartrate solution（酒石酸盐，避光加入） 1ml
依次加入25平方厘米培养瓶，混匀，至于孵箱5min左右，使混合液温度尽量达到37°
5.取出配置好的染液，2ml/well加入6孔板
6.6孔板置于37度孵箱中1h（避光）
7.取出6孔板，超纯水冲洗3次，自然风干后镜下观察

前辈帮忙看下我的步骤哪里不对，求不吝赐教

糊糊胡胡

藤椅 | 回复 | 举报 2015-12-09 10:39

syx117

.染色步骤
1.取6孔板，弃液，加PBS1ml/well清洗，弃PBS
2.4%多聚甲醛（37°左右）1ml/well加入6孔板，置于孵箱25min取出，加1ml/well PBS 清洗
3.1个1.5ml EP管，+fast garnet GBC base solution（氨偶氮卞） 0.5ml
+sodium Nitrite solution(亚硝酸盐) 0.5ml
二者轻轻混匀30秒，室温静置2min
4. 37°超纯水 45ml
步骤3的液体 1ml
Naphthol AS-BI phosphate solution（萘酚） 0.5ml
Acetate solution （醋酸） 2ml
Tartrate solution（酒石酸盐，避光加入） 1ml
依次加入25平方厘米培养瓶，混匀，至于孵箱5min左右，使混合液温度尽量达到37°
5.取出配置好的染液，2ml/well加入6孔板
6.6孔板置于37度孵箱中1h（避光）
7.取出6孔板，超纯水冲洗3次，自然风干后镜下观察
前辈帮忙看下我的步骤哪里不对，求不吝赐教

你好，我们也是用sigma的TRAP试剂盒，步骤和你一样都是按照说明书的，唯一不同是PFA固定的条件和你不同，我们都在室温固定，但固定的影响是否这么大我不确定。因为这个试剂盒很好用，我们实验室如果出现染色失败的情况往往是因为试剂盒保存不当部分试剂失效，或者配制的顺序没有严格按照说明书，还有可能就是样品的问题，比如没有TRAP阳性表达的细胞。
希望能给你提供帮助~

wjxjf900427

板凳 | 回复 | 举报 2015-11-14 17:56

怎么我染的跟你的很类似都好黑啊

sertie

马扎 | 回复 | 举报 2015-12-01 18:58

kamizj891026
各位园子里的大大们，本人小硕，刚刚开始做破骨细胞分化方面的研究，目前遇到一个问题，诱导出来的破骨细胞做TRAP染色颜色不对。本人用的是RAW264.7细胞，诱导4天，TRAP试剂盒是SIGMA的387A。这是诱导的图片，请各位大大帮帮忙，看看问题到底出在哪里？本人感激不尽。
第一张是没染色之前。200x
第二张是染色后 200x

这张是苏木素复染后的。

你好，光镜下看这个肯定是破骨细胞。我用的是RAW264.7细胞，也想诱导形成破骨，细胞状态还可以，小圆，但是不知道为什么，就是诱导不出来这种大的破骨细胞。用的RANKL是peprotech公司的，试过很多次了。请问你这个是铺的六孔板么，细胞铺进去多大的密度？

syx117

地板 | 回复 | 举报 2015-12-04 16:05

sertie
你好，光镜下看这个肯定是破骨细胞。我用的是RAW264.7细胞，也想诱导形成破骨，细胞状态还可以，小圆，但是不知道为什么，就是诱导不出来这种大的破骨细胞。用的RANKL是peprotech公司的，试过很多次了。请问你这个是铺的六孔板么，细胞铺进去多大的密度？

因为RAW264.7长势特别快，我刚开始诱导，铺6孔板，密度大约5W/well。你6孔板密度多少

sertie

6楼 | 回复 | 举报 2015-12-05 20:11

syx117
因为RAW264.7长势特别快，我刚开始诱导，铺6孔板，密度大约5W/well。你6孔板密度多少

5万？那细胞密度非常低。
我没有计数，将单孔皿（六孔板大小）用1ml培养基吹下来，加入了50微到24孔板中，摇匀。我去试试你的密度。请问你用的是pro，还是rd的rankl？

sertie

7楼 | 回复 | 举报 2015-12-05 20:13

kamizj891026
各位园子里的大大们，本人小硕，刚刚开始做破骨细胞分化方面的研究，目前遇到一个问题，诱导出来的破骨细胞做TRAP染色颜色不对。本人用的是RAW264.7细胞，诱导4天，TRAP试剂盒是SIGMA的387A。这是诱导的图片，请各位大大帮帮忙，看看问题到底出在哪里？本人感激不尽。
第一张是没染色之前。200x
第二张是染色后 200x

这张是苏木素复染后的。

另外，我觉得你的这个trap试剂盒估计是有某个试剂失效了。