【求助】Elispot检测单核细胞活化后TNF－α释放...

【求助】Elispot检测单核细胞活化后TNF－α释放

大家快帮帮我。。。真的好着急。。。：（

做ELISPOT实验时，培养基是很重要的一个环节，如果你的培养基中含有热原的话，那么你的ELISPOT中阴性很可能就有一些点出现，还有我不知道你为什么要用磁珠来分离单核细胞？那样有必要吗？在磁珠分离的过程中也有可能受到其他的刺激。还有我不知道你的ELISPOT的基本过程是什么？我把我们的过程大致和你说一下：
1 4度包被抗体过夜
2 PBS洗板一次，封闭1h,
3 洗板4次，加入刺激剂，种入细胞，刺激24h小时
4 PBS 3次，PBST 3次，加入生物素标记的一抗
5 PBST 6次，加入HRP/AP标记的亲和素
6 PBST 3次，PBS 3次，显色

谢谢brisk2004先。
我的培养基是低热原的，包括血清，也是低热原的进口血清。
我第一次做是贴壁分离单核细胞的，结果也是阴性孔有很多点，当时怀疑是不是把单核细胞从平皿上挂下来的时候刺激了它，所以第二次做就用的磁珠阴性分选，这个试剂盒是用磁珠标记除单核以外的单个核细胞的，所以单核细胞理论上应该是不受刺激的。
我的具体过程和您的一样。
1。70％乙醇活化PVDF膜，无菌水洗。
2。4度包被单抗包被过夜
3。PBS洗板5次，37度封闭1h。
4。PBS洗一次或者不洗。加入50微升刺激剂，接着加入100微升细胞，培养24h。
5。倒掉细胞，加入冰冷去离子水，处理10分钟。
6。PBST洗10次，加入生物素标记检测抗体，37度1h
7。PBST洗5次，加入HRP标记亲和素。37度1h
8。PBST洗5次，解冻显色液，每孔100微升，显色5－10分钟。