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2006-02-12 01:28
即:链霉亲和素固相酶免疫测定
固相酶免疫测定方法中，抗原、抗体的包被方式在很大程度上影响敏感度和特异性。在实际应用中与此相关的问题就是解吸附作用、反应性和均一性。 常用的固相包被方法是物理吸附，主要依靠疏水键的力量。在此基础上建立的夹心法ELISA检测抗原的范围一般是1～1000ng/ml，超过此范围，需要对方法进行改进，或对标本进行稀释。 对于检测抗体的间接ELISA方法，物理吸附方法只适用于吸附性能良好的抗原。有许多抗原，如脂多糖、半抗原、合成或重组多肽抗原等，用物理吸附方法，效果常不理想。 针对物理吸附方法固有的缺陷，出现了许多改进的方法。链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)捕获系统就是近年来出现的新型固相。其原理是通过链霉亲和素包被的固相，将生物素标记的抗体、抗原或免疫复合物间接地结合到固相上。 德国宝灵曼公司根据链霉亲和素生物素捕获系统开发了一种通用的固相：聚乙烯管先经过特殊的预处理，再包被上一种“粘性蛋白”和链霉亲和素的结合物。生物素标记的各种类型的抗体，抗原和免疫复合物均能与此种固相结合。该公司生产的ELISA试剂大多采用了这种固相，在心血管疾病标志物、多种激素、药物等的检测中广泛应用。近年开发的电化学发光免疫测定系统中还应用了链霉亲和素包被的磁性微球作为检测固相，使检测灵敏度和检测范围进一步得到了改善。该公司的SA-ELISA板亦已进入市场。 SA-biotin固相酶免疫测定法的关键技术是固相的制备。除宝灵曼公司的专有技术外，文献报道一般有两种方法：SA直接包被方法和BSA-生物素-SA间接包被方法，后者主要是为了克服SA直接吸附效果欠佳的缺陷，BSA起吸附功能，SA起捕获功能。 本论文的主要内容是研究SA包被的新方法，对SA-ELISA进行方法学的探讨及应用研究。结果表明酸处理SA可以提高SA的包被效果；对于夹心ELISA检测抗原，SA固相可以通过显著降低阴性本底来提高检测系统的灵敏度；对于检测抗体，SA固相可以为用直接包被方法效果不好的抗原提供可靠的包被方式。 采用制备的SA酶标板，应用生物素化的抗TnT单抗与酶标记的抗TnT单抗，建立了双抗体夹心一步法ELISA检测血清TnT，较之常规ELISA方法，检测灵敏度提高10倍。与国外同类试剂比较结果表明，本文建立的方法有临床实用价值。 应用酸处理SA酶标板解决了沙门菌LPS脂多糖抗原包被问题，为建立伤寒快速血清学诊断方法及其他细菌脂多糖抗原的包被奠定了基础。 全文主要由四部分组成： 一、链霉亲和素固相酶标板的制备 主要有二种包被方法：酸处理SA直接包被，BSA-biotin-SA间接包被。酸处理SA方法是根据抗体经酸处理后可提高包被效果设计而成的。BSA-biotin-SA间接包被方法是根据以往实验研究的经验，在比较了几种不同包被方法以后，确认BSA-biotin-SA间接包被模式在提高灵敏度方面效果最佳而选定的。实验结果表明，酸处理SA可以提高包被效果，与未处理SA比较，可以减少用量，这对于降低成本极为有利。在BSA-biotin-SA间接包被系统中，生物素化BSA包被以4℃过夜效果好。不同来源的SA对检测系统的灵敏度有很大影响。 二、肌钙蛋白T抗原提纯 TnT抗原是建立血清TnT ELISA检测方法的基础。提纯方法采用了二种方法：柱层析法和改良法。前者按照文献报道的方法进行。主要操作步骤包括：心肌粉的制备，抽提，盐析，过CM-Sephadex C25层析柱和Sephacryl 200层析柱。结果获得了电泳纯的TnT抗原，但是，得率欠佳，制备周期长。改进建立的改良法主要步骤包括：心肌粉制备，抽提，62℃加热，盐析，透析等步骤，结果获得了电泳纯的TnT，得率比柱层析法改善，而且制备周期短，重复性好。 三、SA-ELISA在检测血清TnT中的应用 用提纯的TnT抗原免疫BALB/c小鼠。收集免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA筛选出杂交瘤细胞阳性孔。经过2～3次有限稀释，获得11株分泌抗TnT滴度较高的杂交瘤细胞。选出其中9株腹水效价最高的细胞做进一步分析。经ELISA配对筛选，H〓和E9两种单抗用于建立双位点夹心一步法ELISA检测血清TnT。 采用BSA-biotin-SA酶标板，应用生物素化的抗TnT单抗与酶标记的抗TnT单抗，建立了双抗体夹心一步法ELISA检测血清TnT，与抗体直接包被的常规ELISA和SA包被的ELISA方法比较，BSA-biotin-SA系统的灵敏度最佳，表现为阴性本底最低，检测灵敏度提高约10倍。 临床标本检测发现有非特异性干扰，用小鼠血清可以排除假阳性。同时还发现血清加样体积减少有利于提高检测系统的灵敏度。 与国外同类试剂比较结果表明，本文建立的方法有临床实用价值。国内还未见建立同类方法的报道。 四、SA-ELISA在检测伤寒沙门菌LPS特异性IgM抗体中的应用 LPS是革兰细菌外膜的重要抗原，对细菌血清学诊断具有重要临床意义。但文献报道LPS对塑料的吸附性能不佳。本文试用提纯的伤寒O〓 LPS抗原直接包被酶标板，结果表明这种包被方式不可靠，4℃放置一周，完全失去了免疫活性。 利用LPS的次级胺，制备了生物素化的LPS。生物素的标记浓度以200nmol/l较好。 用酸处理SA酶标板建立了伤寒LPS特异性IgM抗体的快速ELISA检测方法。结果LPS的包被效果明显改善，在4℃放置，免疫活性稳定不变。与未处理SA比较，得到相同的结果，但酸处理SA减少了SA的用量，这对于降低包被成本极为有利。该包被方法也适合其他细菌LPS的包被。 |
已解决
