【求助】实验方法:电化学发光技术..._链霉亲和素结合物_其他免疫产品_抗体类_知道

1 ECL的原理
电化学发光（ECL）是源于电化学法和化学发光法，但又不等同于它们的一种新型的分析方法，是发生在电极表面由稳定的前体产生的具有高度反应性的化学发光反应。发光反应发生在阳极表面 3nm 的激发区内。其化学发光基于三氯联吡啶钌 [Ru （ bpy ） 32+ ] 络合物和三丙胺（ TPA ·）两种电化学活性底物在反应中引起的光子发射。在工作电极上加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌 [Ru （ bpy ） 32+] 发生氧化反应释放电子而成为三价的三氯联吡啶钌 [Ru （ bpy ） 32+] ，与此同时，反应体系中的 TPA ·也在电极表面发生氧化而成为阳离子自由基 TPA+ ，并迅速自发脱去一个质子而形成自由基 TPA ·。由于 [Ru （ bpy ） 32+] 是强氧化剂而 TPA ·是强还原剂，两者即发生氧化还原反应，其结果使 [Ru （ bpy ） 32+] 还原成激发态的 [Ru （ bpy ） 32+] ，其能量来源于 [Ru （ bpy ） 32+] 与 TPA ·之间的电势差，激发态 [Ru （ bpy ） 32+] 以荧光机制衰变并同时释放出一个波长为 62Onm 的光子，而成为基态的 [Ru （ bpy ） 32+] 并继续参与发生在电极表面的化学发光反应，使电极表面的氧化还原反应循环进行，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大提高。

　　在电化学发光反应中，其免疫反应或核酸分析的特异性取决于钌标记的免疫物或核酸探针和 PCR 的引物。常用的钉标记物是 [Ru （ bpy ） 32+] 。 [Ru （ bpy ） 32+] 的盐是很稳定的水溶性化合物，在 -10 ℃至 -30 ℃可稳定 18 个月，经化学修饰后形成 N 羟基琥珀酰胺（ NHS ）酯或磷酞胺化合物。能与蛋白质赖氨酸的ε - 氨基或核酸上的氨基形成稳定的酰胺键。

　　ECL 分析仪的核心系统为 ECL 测量室，它被设计成为一个化学流动室，具备分离结合物和游离物，发生 ECL 反应，清洗测定系统的功能。分离系统采用磁性微球包被链霉亲和素捕获方法，利用生物素棗链霉亲和素的牢固结合力（ KD=1014 ，免疫放大能力和反系统中的磁分离功能，使兔疫反应或核酸反应在磁性微球表面快速进行，结合相和游离相得到有效分离，并使结合相聚集在工作电极表面 3nm 的激发区内，有利于 ECL 的反应并提高了反应灵敏度。 ECL 反应通过在工作电极和参比电极之间加一触发电压而启动。当触发电压以 750mV ／ S 上升至 565mV ～ 1000mV 时， TPA ·在电极表面发生氧化和水解，产生离子的定向流动而形成微弱的电流，当触发电压达到 1100mV 时， [Ru （ bpy ） 32+] 开始被氧化形成 [Ru （ bpy ） 32+] ，发生 ECL 。反应迅速释放出光子，通过光电倍增管测量 ECL 的照光度。清洗系统采用碱性溶液去除电极表面的蛋白质，并在电极同加一高电压，诱发氢氧化物形成，该物质可以擦亮电极，除去电极表面的任何微粒和氧化物等。

2 ECL 的特点

　　ECL 技术是电化学技术和化学发光技术相结合的新型免疫分析方法，与普通的化学发光（酶促发光或生物发光）有显著的区别。前者为电促发光，在电极表面通过三角形脉冲电压的激发产生稳定、连续、高效的发光，后者则是标记辣根过氧化物酶作用下催化化学发光剂如鲁米那、吖啶酯等产生不稳定、间断、闪烁性的发光，且反应过程中容易发生裂变而使结果不稳定。 ECL 测定的照光度根据释放光子的波长仍属荧光测定的范畴，但与直接的荧光发光不同，荧光发光的灵敏度受荧光发光的本底和光学部件散射光的影响，适应范围也较低。

　　由于 ECL 是一种电促发光技术，采用特殊的化学发光剂作为标记物，既避免了同位素的半衰期短及放射性危害，又克服了酶标记的不稳定性，而标记物。 [Ru （ bpy ） 32+] 很稳定，在室温下半衰期大于一年，经化学修饰的形成有活性的 NHS 酯或磷酰胺基团很容易与蛋白质、激素、核酸、半抗原等分子结合，从而达到更广泛的分析适用性，所形成的 [Ru （ bpy ） 32+] 结合物其活性在· 2 ℃～ 5 ℃可保持一年以上。由于 [Ru （ bpy ） 32+] 的分子量较小，在一个抗体等分子上，可同时标记上多个标记物（＞ 20 个）而不影响抗体活性，也可用于核酸和 PCR 引物的标记，而不影响探针的杂交活性和引物的特异性，标记物在 ECL 反应中循环利用，使发光时间更长，强度更高。同时在兔疫反应和核酸检测中，将链霉亲和素系统与磁性微球技术结合，使检测灵敏度达到更高（＜ lpmol ），线性范围更宽（ 104 ），反应时间更短（＜ 2Omin ），自动分离游离相和结合相，使测定步骤大大简化，分析更易自动化。由于 ECL 技术比 ELlsA 、 RIA 及传统的化学发光具有更显著的优越性，且其设计上的灵活性使分析者可灵活设计测定摸式，因而在兔疫分析特别是在核酸测定中具有非常诱人的前景。

3 ECL 在核酸测定中的应用

　　随着分子生物学在医学领域的广泛应用，对检测标本的核酸进行定量分析，为临床准确、及时的诊断疾病，监测治疗效果已显得十分必要。常用的核酸分析方法包括 Southern b1ot 和 Northern b1ot 印迹杂交等，这些方法由于敏感性低而不能检出基因剂量的微小差异。同时也因操作方法繁杂，费时而难于在临床推广应用。 PCR 技术则可克服上述缺点。利用 PCR 原理，对引物标记同位素，荧光素或酶可以定性分析标本中的核酸．而将引物进行钌标记后，对 PCR 反应后的产物在 ECL 仪上检测而进行定量分析则可避免酶标记和荧光标记的不稳定性和敏感性较低及影响杂交特异性的缺点，也可避免同位素标记的放射性污染，并可结合 ECL 仪进行自动化分析。

3.1 引物的钌标记

ECL测定的常用钌标记物是 [Ru （ bpy ） 32+] ．该钌螯合物经 N 羟基琥珀酰胺或磷酸酰胺活化后形成活性的 [Ru （ bpy ） 32+]NHS 酯（ Origen ）或 [Ru （ bpy ） 32+] 磷酰胺基团（ Origen phoshporamidite ）能与合成的寡核苷酸引物结合，生成 [Ru （ bpy ） 32+] 标记的寡核普酸引物或探针。溶于二甲亚砜中的 Origen 与寡核苷酸的氨基在 pH7.4 的 PBS 中室温避光过夜，用乙醇沉淀除去未结合的寡核苷酸，并用 HPLC 提纯标记的引物。研究证实 80 ％以上的寡核苷酸能与 Origen 进行有效的结合。 Kenten 等 [7] 用 Origer phosphoramidite 代替 Origen ，证实该活性钌螯合物较 Origen 有显著的优点；能在 DNA 合成仪合成引物的同时自动进行标记，无需分离提纯，标记有效率＞ 90 ％，不影响杂交稳定性、耐热，不受电化学中其他化学反应的干扰和内源性的金属离子干扰，经对 AIDS 病人末梢血淋巴细胞 HIV1 的 gag 基因检测分析，其灵敏度高于 Origen 。

3.2 检测模式

3.2.1 直接法
　　将一对生物素和钌标记的引物在 DNA 聚合酶作用下进行 PCR 反应，其反应产物与链霉亲和素包被的磁性微球结合，除去游离相并用缓冲液洗涤微球，最后将吸附钌标记物的 DNA 扩增产物的磁性微球重新悬于一定体积的缓冲液中，用 ECL 仪测定照光度根据标准曲线算出标本中核酸含量。 Motmans 等用该法定量检测由相关基因转染的人 T 细胞肿瘤坏死因子（ TNF- α）γ - 干扰素（ IFN- γ）和白细胞介素 2 （ IL-2 ）的 mRNA 水平。将 T 细胞的 mRNA 提取后反转录成 cDNA ，用一对分别标记钌和生物素的引物进行扩增，扩增产物用 ECL 进行检测，其最低检测限分别为 600 、 57Oamol 和 485amol （ lamol=10 一 18mol ），线性范围达到 10 3 。 Vandevyver 等也利用 ECL 直接法测定细胞因子 mRNA 的表达，其准确性和精密度均令人满意，用人工合成的 DNA 作标准，通过内标法快速进行定量测定。

3.2.2 间接法
　将一生物素标记的引物和未标记的引物首先进行 PCR 反应，其反应产物与链霉亲和素包被的磁性微球在室温下孵育，除去游离相，并用 NaOH 将生物素 - 链霉亲和素结合在磁性微球上的 DNA 扩增产物双链解离悬浮于杂交缓冲液中，加入钌标记的引物于 66 ℃反应 15min 后成为双链 DNA ，分离磁性微球并用两种缓冲液洗涤，最后将微球重新悬浮于 Origen 分析液中，用 ECL 仪测定用光度。据此求得样本中的核酸浓度。

3.2.3 不对称法
先将未标记的引物和比未标记的引物浓度大 10 倍的生物素标记的引物首先进行 PCR 反应，结果产生大量的生物素化的单链 DNA ，然后加入钌标记的探针， 50 ℃， 15min 后，将反应产物加入含有链霉亲和素包被的磁性微球的 origen 分析液中，室温孵育 15min 并振摇，最后将反应波用 ECL 仪测定其用光度。

希望对你有帮助，其实这方面文献很多，自己找找看看啦！

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1 ECL的原理
电化学发光（ECL）是源于电化学法和化学发光法，但又不等同于它们的一种新型的分析方法，是发生在电极表面由稳定的前体产生的具有高度反应性的化学发光反应。发光反应发生在阳极表面 3nm 的激发区内。其化学发光基于三氯联吡啶钌 [Ru （ bpy ） 32+ ] 络合物和三丙胺（ TPA ·）两种电化学活性底物在反应中引起的光子发射。在工作电极上加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌 [Ru （ bpy ） 32+] 发生氧化反应释放电子而成为三价的三氯联吡啶钌 [Ru （ bpy ） 32+] ，与此同时，反应体系中的 TPA ·也在电极表面发生氧化而成为阳离子自由基 TPA+ ，并迅速自发脱去一个质子而形成自由基 TPA ·。由于 [Ru （ bpy ） 32+] 是强氧化剂而 TPA ·是强还原剂，两者即发生氧化还原反应，其结果使 [Ru （ bpy ） 32+] 还原成激发态的 [Ru （ bpy ） 32+] ，其能量来源于 [Ru （ bpy ） 32+] 与 TPA ·之间的电势差，激发态 [Ru （ bpy ） 32+] 以荧光机制衰变并同时释放出一个波长为 62Onm 的光子，而成为基态的 [Ru （ bpy ） 32+] 并继续参与发生在电极表面的化学发光反应，使电极表面的氧化还原反应循环进行，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大提高。

　　在电化学发光反应中，其免疫反应或核酸分析的特异性取决于钌标记的免疫物或核酸探针和 PCR 的引物。常用的钉标记物是 [Ru （ bpy ） 32+] 。 [Ru （ bpy ） 32+] 的盐是很稳定的水溶性化合物，在 -10 ℃至 -30 ℃可稳定 18 个月，经化学修饰后形成 N 羟基琥珀酰胺（ NHS ）酯或磷酞胺化合物。能与蛋白质赖氨酸的ε - 氨基或核酸上的氨基形成稳定的酰胺键。

　　ECL 分析仪的核心系统为 ECL 测量室，它被设计成为一个化学流动室，具备分离结合物和游离物，发生 ECL 反应，清洗测定系统的功能。分离系统采用磁性微球包被链霉亲和素捕获方法，利用生物素棗链霉亲和素的牢固结合力（ KD=1014 ，免疫放大能力和反系统中的磁分离功能，使兔疫反应或核酸反应在磁性微球表面快速进行，结合相和游离相得到有效分离，并使结合相聚集在工作电极表面 3nm 的激发区内，有利于 ECL 的反应并提高了反应灵敏度。 ECL 反应通过在工作电极和参比电极之间加一触发电压而启动。当触发电压以 750mV ／ S 上升至 565mV ～ 1000mV 时， TPA ·在电极表面发生氧化和水解，产生离子的定向流动而形成微弱的电流，当触发电压达到 1100mV 时， [Ru （ bpy ） 32+] 开始被氧化形成 [Ru （ bpy ） 32+] ，发生 ECL 。反应迅速释放出光子，通过光电倍增管测量 ECL 的照光度。清洗系统采用碱性溶液去除电极表面的蛋白质，并在电极同加一高电压，诱发氢氧化物形成，该物质可以擦亮电极，除去电极表面的任何微粒和氧化物等。

2 ECL 的特点

　　ECL 技术是电化学技术和化学发光技术相结合的新型免疫分析方法，与普通的化学发光（酶促发光或生物发光）有显著的区别。前者为电促发光，在电极表面通过三角形脉冲电压的激发产生稳定、连续、高效的发光，后者则是标记辣根过氧化物酶作用下催化化学发光剂如鲁米那、吖啶酯等产生不稳定、间断、闪烁性的发光，且反应过程中容易发生裂变而使结果不稳定。 ECL 测定的照光度根据释放光子的波长仍属荧光测定的范畴，但与直接的荧光发光不同，荧光发光的灵敏度受荧光发光的本底和光学部件散射光的影响，适应范围也较低。

　　由于 ECL 是一种电促发光技术，采用特殊的化学发光剂作为标记物，既避免了同位素的半衰期短及放射性危害，又克服了酶标记的不稳定性，而标记物。 [Ru （ bpy ） 32+] 很稳定，在室温下半衰期大于一年，经化学修饰的形成有活性的 NHS 酯或磷酰胺基团很容易与蛋白质、激素、核酸、半抗原等分子结合，从而达到更广泛的分析适用性，所形成的 [Ru （ bpy ） 32+] 结合物其活性在· 2 ℃～ 5 ℃可保持一年以上。由于 [Ru （ bpy ） 32+] 的分子量较小，在一个抗体等分子上，可同时标记上多个标记物（＞ 20 个）而不影响抗体活性，也可用于核酸和 PCR 引物的标记，而不影响探针的杂交活性和引物的特异性，标记物在 ECL 反应中循环利用，使发光时间更长，强度更高。同时在兔疫反应和核酸检测中，将链霉亲和素系统与磁性微球技术结合，使检测灵敏度达到更高（＜ lpmol ），线性范围更宽（ 104 ），反应时间更短（＜ 2Omin ），自动分离游离相和结合相，使测定步骤大大简化，分析更易自动化。由于 ECL 技术比 ELlsA 、 RIA 及传统的化学发光具有更显著的优越性，且其设计上的灵活性使分析者可灵活设计测定摸式，因而在兔疫分析特别是在核酸测定中具有非常诱人的前景。

3 ECL 在核酸测定中的应用

　　随着分子生物学在医学领域的广泛应用，对检测标本的核酸进行定量分析，为临床准确、及时的诊断疾病，监测治疗效果已显得十分必要。常用的核酸分析方法包括 Southern b1ot 和 Northern b1ot 印迹杂交等，这些方法由于敏感性低而不能检出基因剂量的微小差异。同时也因操作方法繁杂，费时而难于在临床推广应用。 PCR 技术则可克服上述缺点。利用 PCR 原理，对引物标记同位素，荧光素或酶可以定性分析标本中的核酸．而将引物进行钌标记后，对 PCR 反应后的产物在 ECL 仪上检测而进行定量分析则可避免酶标记和荧光标记的不稳定性和敏感性较低及影响杂交特异性的缺点，也可避免同位素标记的放射性污染，并可结合 ECL 仪进行自动化分析。

3.1 引物的钌标记

ECL测定的常用钌标记物是 [Ru （ bpy ） 32+] ．该钌螯合物经 N 羟基琥珀酰胺或磷酸酰胺活化后形成活性的 [Ru （ bpy ） 32+]NHS 酯（ Origen ）或 [Ru （ bpy ） 32+] 磷酰胺基团（ Origen phoshporamidite ）能与合成的寡核苷酸引物结合，生成 [Ru （ bpy ） 32+] 标记的寡核普酸引物或探针。溶于二甲亚砜中的 Origen 与寡核苷酸的氨基在 pH7.4 的 PBS 中室温避光过夜，用乙醇沉淀除去未结合的寡核苷酸，并用 HPLC 提纯标记的引物。研究证实 80 ％以上的寡核苷酸能与 Origen 进行有效的结合。 Kenten 等 [7] 用 Origer phosphoramidite 代替 Origen ，证实该活性钌螯合物较 Origen 有显著的优点；能在 DNA 合成仪合成引物的同时自动进行标记，无需分离提纯，标记有效率＞ 90 ％，不影响杂交稳定性、耐热，不受电化学中其他化学反应的干扰和内源性的金属离子干扰，经对 AIDS 病人末梢血淋巴细胞 HIV1 的 gag 基因检测分析，其灵敏度高于 Origen 。

3.2 检测模式

3.2.1 直接法
　　将一对生物素和钌标记的引物在 DNA 聚合酶作用下进行 PCR 反应，其反应产物与链霉亲和素包被的磁性微球结合，除去游离相并用缓冲液洗涤微球，最后将吸附钌标记物的 DNA 扩增产物的磁性微球重新悬于一定体积的缓冲液中，用 ECL 仪测定照光度根据标准曲线算出标本中核酸含量。 Motmans 等用该法定量检测由相关基因转染的人 T 细胞肿瘤坏死因子（ TNF- α）γ - 干扰素（ IFN- γ）和白细胞介素 2 （ IL-2 ）的 mRNA 水平。将 T 细胞的 mRNA 提取后反转录成 cDNA ，用一对分别标记钌和生物素的引物进行扩增，扩增产物用 ECL 进行检测，其最低检测限分别为 600 、 57Oamol 和 485amol （ lamol=10 一 18mol ），线性范围达到 10 3 。 Vandevyver 等也利用 ECL 直接法测定细胞因子 mRNA 的表达，其准确性和精密度均令人满意，用人工合成的 DNA 作标准，通过内标法快速进行定量测定。

3.2.2 间接法
　将一生物素标记的引物和未标记的引物首先进行 PCR 反应，其反应产物与链霉亲和素包被的磁性微球在室温下孵育，除去游离相，并用 NaOH 将生物素 - 链霉亲和素结合在磁性微球上的 DNA 扩增产物双链解离悬浮于杂交缓冲液中，加入钌标记的引物于 66 ℃反应 15min 后成为双链 DNA ，分离磁性微球并用两种缓冲液洗涤，最后将微球重新悬浮于 Origen 分析液中，用 ECL 仪测定用光度。据此求得样本中的核酸浓度。

3.2.3 不对称法
先将未标记的引物和比未标记的引物浓度大 10 倍的生物素标记的引物首先进行 PCR 反应，结果产生大量的生物素化的单链 DNA ，然后加入钌标记的探针， 50 ℃， 15min 后，将反应产物加入含有链霉亲和素包被的磁性微球的 origen 分析液中，室温孵育 15min 并振摇，最后将反应波用 ECL 仪测定其用光度。

希望对你有帮助，其实这方面文献很多，自己找找看看啦！

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