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2017-10-03 05:40
电镜法
直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，EM 法观察的灵敏度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。 免疫法 包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA法的灵敏度比IEM 法可 提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是可广泛应用的检测方法。由于NLV培养还未成功，原来用作试剂的病毒抗原数量受到限制，用分子生物学技术已经可以人工重组NV的衣壳蛋白，从而解决了上述问题。 分子生物学检测方法 杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度的NV感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。 等温核酸扩增法 (NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV，样品中病原RNA得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法；整个过程只有一步RNA扩增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；缩短了操作时间；假阳性率低。 RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。 病毒浓缩 病毒浓缩 NV 浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品 pH 值，使毒粒与样品微粒分开，PEG 把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。 膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。 核酸提取 食品样品成分复杂，所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是 RT-PCR 反应抑制因子。NV是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀 RNA 相比起来，效果较好，只是成本偏高。展开 |
已解决
