【分享】荧光定量PCR详细流程和问题解析...

【分享】荧光定量PCR详细流程和问题解析

很好很强大

太感激了，学到了很多。我进实验室已经三个月了，从一窍不通到现在一片混乱，日子太难过了。读了楼主的文章，虽然不能全懂，但是感觉心中有了几缕阳光。感谢！
这三个月简直是我目前人生中最难熬的一段日子。

学习了，非常好，希望能深入讨论！

好贴
谁能帮我详细的解释下面这句话是什么意思？

在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增？？？

回LS：不对的请指出哈
1、如果两个引物分别分布在两个外显子上，外显子之间存在一个或多个内含子，那么cDNA扩增得到的PCR产物当然小于来自基因组的PCR产物；另外Taq酶对PCR产物的合成长度是有一定限制的，并且在较短的延伸时间内也完成不了长片段的延伸。所以，如果来自基因组的PCR产物如果能顺利P出来，它的大小也是大于来自cDNA的，这在电泳时容易区分的；要么根本就P不出来的。
2、如果其中一个引物是由一个外显子尾部和下一个外显子头部拼接而成的话，那么此时的引物只能P出cDNA的产物，根本就不会把基因组的P出来。

谢谢楼上的解答，基本明白了
不过还有一个问题：
如果要研究的目的片短只是一个外显子，这样的话是不是就不好办了，因为这样设计引物的时候要么只能将引物放在目的外显子内，要么只能放在内含子内

谢谢，呵呵

先收一下 最近在做real-time 有空来交流

横空出世高人一枚,汇总得很好,学习了:D

Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。
个人以前并没听过这个说法.楼主可否将这个问题阐述一下?

还有这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。
是一个基因就消耗一个模板的意思?恐怕......

好小猫
好贴
谁能帮我详细的解释下面这句话是什么意思？

在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增？？？

RT-PCR的主要问题是RNA样品中存在gDNA污染。这样会引起假阳性的发生、特异性降低，或者特定RNA含量测量值偏高。
为了排除gDNA的污染对实验结果的影响，可以在特定的位置设计引物。
如下图：
1、在外显子与外显子连接处设计一条引物，另一条在外显子处。这样gDNA不会被扩增，而mRNA/cDNA可以扩增。
2、设计跨外显子、内含子的引物（一条或一对）。这样，mRNA/cDNA不会被扩增，而gDNA可以扩增。
3、在内含子两侧的外显子设计引物。gDNA扩增得到大扩增产物，mRNA/cDNA扩增得到小扩增产物。然后通过电泳等方法区别。

具体图解请看附件！

cDNA被扩增，而gDNA不会.doc(55.5k)