[求助]【求助】刚开始接触荧光定量PCR，请大家帮帮忙...

[求助]【求助】刚开始接触荧光定量PCR，请大家帮帮忙

我接触的时间也不长，可以交流一下经验。
（2）对于荧光定量检测，先前设计的引物应该可以适用。如果采用SYBR Green法，没太大问题，但用TaqMan探针法的话，就要对引物及探针进行评估。（3）如果找公司合成探针的话，就可以让公司给设计，只要提供模板即可，反正又不收费，而且人家有经验。当然自己设计也可以了。
（4）确实像你说的，国外和国内合成都可以，只是现在有些大公司的跟踪服务好一些，会减少摸索试验条件的时间等。以我们这的试验结果来看，国内的探针设计的也都还不错。
（5）试剂盒里只有酶等反应体系，不包括探针和引物，这些都是需要根据你的模板具体进行设计的。而试剂盒是通用的，比如SYBR Green试剂盒啊，里面就包括酶、SYBR Green染料等，按照说明加入模板和引物就可以了；探针类的试剂盒包括酶等，加入模板、引物和探针可以进行反应。价格还可以，以一般最小包装来计，国内的1500左右，国外的2000或以上吧。
其实只有把试验理顺了，荧光定联PCR没有那么可怕，祝你成功！

偶来答答～～
1. 片段大小一致应该是跑marker得出的结论吧？这个只能是个大致值，并不能肯定和你所需要的片段完全一致，就算一致，也有可能运气不好是非特异扩增。测序是确定片段是否是你所需的唯一、最终的金标准。

2、3. 如果以前那对引物扩增片段在250以内的话，可以用sybr green法做荧光定量。如果taqman探针法的话，就要重新设计。taqman探针可以用ABI公司的primer express设计（并非primer 5），然后给公司合成。当然参考国外文献上的引物探针也未尝不可，只是有些文献如果设计到知识产权的话，作者可能会更改引物序列。

4. 国内国外引物探针应该差不多。但现在很多国内的什么什么公司其实就是国外公司的代理～～

5. 偶没用过试剂盒。不过有些专门针对某些病原微生物的，其中是有相应的引物探针的，如乙肝定量检测试剂盒。sybr green的试剂盒如huixu 所说，可能有的有rox试剂。其它的就由其它战友补充了～～

6. 病原微生物的定量检测研究的确很多，难度也大些。主要是个检测方法的特异性和灵敏度的问题。因为病原微生物变异大，而定量方法比较灵敏，尤其taqman探针序列上的变异就可能导致检测结果的遗漏，所以都还需要不断摸索～～

谢谢楼上两位的热心解答