IBC会议Audrey Jia 的报告：细胞系开发中涉及细胞...

看完PPT想与大家谈论

过去美国是如何进行的，是否有因为单克隆的问题，项目失败或者曲折（由于不是单克隆，培养工艺处问题）的先例；技术都是随着需要发展而发展的，早些年估计也是稀里糊涂干的。

现在强调单克隆性肯定是对的，但是如果没有这方面的记录或者证明，那将来审评或者审批是否意味着项目死掉，如楼主所述，在临床三期前必须确定，有图像证据能证明也可以。但是如果没有图像证明，采用传统方法只进行了一轮有限稀释挑选的克隆做的临床I和II期，三期前进行新一轮的克隆筛选，并且建立新的MCB和WCB，并且和之前的批次进行变更对比。

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在没有客观图像技术之前，只能靠两轮以上的有限稀释法来来保证克隆的单克隆性，这也是所说的理论上相对单克隆性。强调单克隆性其实是为了降低自己以后生产的风险，如果不是单克隆的话一个药买了几年以后就会不一样了。

理论上是指0.5个细胞每孔接种96孔板然后长出的克隆，经过两轮亚克隆应该可以达到相对纯度的单克隆。其实也有一个笨方法我以前也用过的，等接种以后，可以在显微镜下观察每个96孔板的细胞个数，然后标记有一个细胞的孔。最后挑克隆的时候就挑这些标记的孔，观察的过程会很累的，可以尝试一下感觉

杂交瘤细胞都是这样做法，因为杂交瘤是贴壁生长的，比较容易看清，但是CHO细胞是悬浮的，从培养箱中拿出来的时候还有可能晃动，估计辨别起来有点难度吧。

一般都是培养箱中静置4个小时以后再观察的，没有条件的时候只能用显微镜观察。贴一张之前拍下来的单克隆形成过程。缺点就是有细胞影子，可能是板子反光原因。

你这是用什么拍的啊？直接在显微镜下用相机拍摄的？？

去年买的一台设备拍的，为了今年准备报FDA临床准备的。我觉得把这个图像数据甩到审查员面前，应该没什么话说了。

相当可以，很直观啊。这个影子主要还是细胞悬浮在培养基里造成的吧？

是板子的质量不好引起的折光，然后就出现影子的。有的孔就不会出现这样的情况，所以需要用好的板子。

......

刚才关于细胞影子问题，已得到专家解释了。贴出来和大家分享一下；

一般发现，在靠近孔边缘的时候，容易出现细胞影子的现象。主要的原因是：由于液面表面张力的关系，在孔边缘形成弧形液面，导致光折射及孔壁反射形成的影子。可以两种方式比较好的解决：1. 降低液面高度，即铺板体积减小，后期再补液。这样可以比较有效地降低影子的范围和清晰度；2. 改用黑壁底透的培养板。

只听了几个报告，了解的比较少。但Audrey的报告，因为其他的原因，我倒是听了好几遍。涉及比较有意思的几点：

1. 有限稀释法的铺板浓度必须小于0.5 cell/well。这是经验，同时也是FDA比较认可的方式，高于0.5的话，单克隆率太低，尤其在无Imager的情况下，得到单克隆细胞株的概率较低。在使用Imager的情况下，单克隆概率的问题影响不大，但铺板浓度会影响克隆总数及单克隆的比率，因此，她还是建议小于0.5cell/well，公司研究人员可根据自己项目情况进行合理的浓度优化。

2. 关于非人源检测试剂及添加物的处置。这主要针对Clonepix及FACS，由于这两种挑选或者铺板方式会涉及试剂或者添加物，如二抗（鼠源、兔源、山羊源等），Protein A/G(Clonepix中用于标示表达IgG浓度的)，甲基纤维素，荧光标签等。针对这些添加物，必须进行风险控制（风险由IND、CDE申请者承担），包括来源说明，成分define，残留检测，对细胞的影响等。每一项的检测都会涉及方法的开发以及方法学的验证，很累也很难！

3. FACS和Clonepix的交叉污染的问题。这个交叉污染主要是指不同项目/细胞株使用同一套设备进行克隆挑选，如何对不同项目/细胞株交叉污染进行控制，并确认，以及方法和流程如何等。关于这一点，我跟不少客户聊起来过，交叉污染的控制是国内不少客户最终决定放弃FACS和Clonpix挑选细胞的最主要原因。这一点上，与国外知名药企不同的是（如Roche），他们对于FACS和Clonepix有10几年的使用经验，并具有完整的技术手段及反复验证过的方法进行风险控制；而国内企业缺乏这方面的技术储备，很难实现，或者实现的代价过高。

4. 临床申请的细胞系单克隆要求。根据Audrey建议，起始美国FDA在临床一期并不会对申请者明确要求单克隆源性，但是临床三期必须确认。Audrey的解释：风险自担！为了能比竞争对手更快上临床，有些客户愿意承担这个风险。（在会场上有一个参会老师提问，国外某知名药企甚至有用顺转细胞系申请临床）。但无论如何，三期必须提供细胞系的单克隆源性证据。临床前不做，那么临床三期前，必须从头再来一遍。

这点上的理念，可能跟国内有很大差别：首先，国内尚未要求细胞系的单克隆源性，如果不是海外也报临床，一些企业认为不用做，或者无所谓；其次：误会国外某知名企业，未提供单克隆源性，也能直接开始临床一期，他们也可以跟着这么做，殊不知项目管理、风险控制及资源根本不在一个数量级；再次：国内很多小一点的企业，并不打算自己直接将项目做到三期，基本上做到临床前就转让了，单克隆源性也就不那么重要了。

5. Solentim（品牌）Cell Metric（型号）使用Tips。应该也有不少我的客户在园子里面，可能你们了解，也可能我没提及，这里简单说一点点。1. 疑罪从无。任何存在单克隆性判断上存在疑虑/争议的，必须放弃或再亚克隆；2. 可在正式铺板前，在准备铺板的细胞板中，加入少量的无细胞培养基，并进行成像，获得板的基础背景，可以更为有效地判断细胞单克隆性；3. 铺板浓度最好进行一定的优化，以获得较好的细胞clony总数和细胞单克隆孔数量。这会大大提高细胞筛选效率；4. 在挑好合适的单克隆孔以后，请及时对该孔做好Tag及Annotation，这样在最后出具单克隆源性报告时，会大大降低工作量并不容易出错。

好在单克隆源性，在国内也越来越被重视，也是一种法规倒逼（对我这样做业务的来说绝对是好事，呵呵）。目前，感觉下来，使用Imager方式比较有吸引力的主要两点：1. 直接的影像证据，说明细胞系的单克隆源性，比单纯的单克隆泊松分布概率更严谨，也更有说服力；2. 一旦确定单克隆源性，无需第二轮有限稀释，节省开发时间。

谢谢分享，很受用！

看完PPT想与大家谈论

过去美国是如何进行的，是否有因为单克隆的问题，项目失败或者曲折（由于不是单克隆，培养工艺处问题）的先例；技术都是随着需要发展而发展的，早些年估计也是稀里糊涂干的。

现在强调单克隆性肯定是对的，但是如果没有这方面的记录或者证明，那将来审评或者审批是否意味着项目死掉，如楼主所述，在临床三期前必须确定，有图像证据能证明也可以。但是如果没有图像证明，采用传统方法只进行了一轮有限稀释挑选的克隆做的临床I和II期，三期前进行新一轮的克隆筛选，并且建立新的MCB和WCB，并且和之前的批次进行变更对比。

在没有客观图像技术之前，只能靠两轮以上的有限稀释法来来保证克隆的单克隆性，这也是所说的理论上相对单克隆性。强调单克隆性其实是为了降低自己以后生产的风险，如果不是单克隆的话一个药买了几年以后就会不一样了。

理论上是指0.5个细胞每孔接种96孔板然后长出的克隆，经过两轮亚克隆应该可以达到相对纯度的单克隆。其实也有一个笨方法我以前也用过的，等接种以后，可以在显微镜下观察每个96孔板的细胞个数，然后标记有一个细胞的孔。最后挑克隆的时候就挑这些标记的孔，观察的过程会很累的，可以尝试一下感觉

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jackieustc

看完PPT想与大家谈论

过去美国是如何进行的，是否有因为单克隆的问题，项目失败或者曲折（由于不是单克隆，培养工艺处问题）的先例；技术都是随着需要发展而发展的，早些年估计也是稀里糊涂干的。

现在强调单克隆性肯定是对的，但是如果没有这方面的记录或者证明，那将来审评或者审批是否意味着项目死掉，如楼主所述，在临床三期前必须确定，有图像证据能证明也可以。但是如果没有图像证明，采用传统方法只进行了一轮有限稀释挑选的克隆做的临床I和II期，三期前进行新一轮的克隆筛选，并且建立新的MCB和WCB，并且和之前的批次进行变更对比。

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在单克隆源性证据提出来以前，基本上是两轮有限稀释是可以接受的（<0.5 cell/well, 2 rounds, clonality possiblity >95%）。后来又提出需辅以泊松分布来预估单克隆概率，再后来发现泊松分布的概率会与实际差别较大（用Imager验证泊松分布），到现在是普遍希望用Imager方式提供可观细胞单克隆的证据。

关于案例，贾老师的PPT第21页，列举了IND/CDE申请遇到的三个客户案例（有她经手的，也有她同事经手的），最后发现均是由于细胞非单克隆导致的。这个问题，我也请教过：项目终止可能性不大，但是制药企业为此付出的肯定不少。

关于Imager提供单克隆源性证据是否必须，我的个人观点：1. 非必须，只是影像可观的证明更为简便。起码在目前，用传统的2轮有限稀释仍然是被接受的；2. 竞争的倒逼，这种情况在国内可能会更严重。一旦较多的制药企业采用Imager方式来证明单克隆源性，那么剩余其他的也必将跟进，采用这种更为客观有效的方式；3. Imager能更省时间啊，一旦确定了单克隆源性，无需第二轮亚克隆。最后这一点，对我们业务而言绝对是Most Valuable Demand.

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laorentou

在没有客观图像技术之前，只能靠两轮以上的有限稀释法来来保证克隆的单克隆性，这也是所说的理论上相对单克隆性。强调单克隆性其实是为了降低自己以后生产的风险，如果不是单克隆的话一个药买了几年以后就会不一样了。

理论上是指0.5个细胞每孔接种96孔板然后长出的克隆，经过两轮亚克隆应该可以达到相对纯度的单克隆。其实也有一个笨方法我以前也用过的，等接种以后，可以在显微镜下观察每个96孔板的细胞个数，然后标记有一个细胞的孔。最后挑克隆的时候就挑这些标记的孔，观察的过程会很累的，可以尝试一下感觉

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附件是澳大利亚CSL公司的Arna一个PPT报告（他也是我们代理产品的一个客户，呵呵）。Arna在报告中列出了很多的数据，包括概率分布分析，1~3轮有限稀释对单克隆源性的影响，等等。

可以再探讨探讨。呵呵。

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在没有客观图像技术之前，只能靠两轮以上的有限稀释法来来保证克隆的单克隆性，这也是所说的理论上相对单克隆性。强调单克隆性其实是为了降低自己以后生产的风险，如果不是单克隆的话一个药买了几年以后就会不一样了。

理论上是指0.5个细胞每孔接种96孔板然后长出的克隆，经过两轮亚克隆应该可以达到相对纯度的单克隆。其实也有一个笨方法我以前也用过的，等接种以后，可以在显微镜下观察每个96孔板的细胞个数，然后标记有一个细胞的孔。最后挑克隆的时候就挑这些标记的孔，观察的过程会很累的，可以尝试一下感觉

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杂交瘤细胞都是这样做法，因为杂交瘤是贴壁生长的，比较容易看清，但是CHO细胞是悬浮的，从培养箱中拿出来的时候还有可能晃动，估计辨别起来有点难度吧。