单个核细胞细胞分离...

有几个地方可以探讨一下：

1. 灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。

2. 我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.

3. 剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。

4. 消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。

5. 铺板4-6小时后，换一下液。

另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。

有几个地方可以探讨一下：

1. 灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。

2. 我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.

3. 剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。

4. 消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。

5. 铺板4-6小时后，换一下液。

另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。

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首先非常感谢您的回复！以下还有几点希望与您讨论！

1.关于灌注方向，我准备按照您的方向试一下，门静脉穿刺确实很不稳定；

2.您们用的是0.01%的胶原酶，请问是什么牌子的，可否提供下货号；

3.是直接用除胶原酶外的消化液直接溶解胶原酶粉是吗；

4.整个过程持续一个小时的话，那您们是用什么针穿刺血管并且固定的呢（一个小时如果一直用手把着是不是太不稳定而且劳累了呢）；

5.培养基温度也准备用37度的试一下；我消化的肝脏可以看到mushy的感觉，但并不是每一叶都是一点即破，消化成都感觉不尽相同，这是由于穿刺针（我用的24G留置针软针管灌注）进入血管太深导致的吗，还是什么原因呢？

6.取下的肝脏里面仍然有需要用镊子撕扯的结缔组织，这是否说明消化并不完全？加大浓度或消化液关灌注量时又怕被过度消化而导致细胞死亡，关于这一点，请问有什么好建议吗？

7.抖落的肝脏细胞不离心直接染色观察，会发现大部分为死细胞，请问这是正常的吗？（此时镜下观察应该是什么样的呢） （为什么会有很多死细胞）这种情况在完成细胞离心及密度分离之后，得到改善，镜下活细胞比例增加。

期待回复~~

bighead1985

有几个地方可以探讨一下：

1. 灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。

2. 我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.

3. 剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。

4. 消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。

5. 铺板4-6小时后，换一下液。

另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。

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chenmo212003

我们灌注方法也是下腔静脉进针，剪断门静脉。所有试剂都是预热或者室温状态。胶原酶选用的是sigma的C5138，灌注时间大概一刻钟就可以了，可能我们的酶浓度比较高，120ml 60mg。个人感觉没必要用棉棒按压，过程当中可以感觉肝脏明显变大变黄白。所用手术器械酒精擦拭消毒即可。Percoll密度离心之后下层细胞存活率很高。