【求助】酵母细胞破碎...

【求助】酵母细胞破碎

楼主，我正在提酵母中的dna呢，呵呵。同志啊
提了两天了，还没有成功。
前天大提了一次，最后竟然一点也没有。然后昨天我把前天大题离心下来的菌体再重新破壁了1个小时，然后就提出来了。但量太少了，等除了rna后竟然又消失了，郁闷
今天有提了一下，破壁3个小时，提取不出来，现在在提破壁6小时的，希望一会儿能提出来。
同时现在大题破壁，准备过夜破壁，明天接着提。

估计是破壁不成功，需要很长时间破壁才成。

下面是我的提取流程，仅供参考，呵呵

接种C18和C19于25 ml的YEPD液体培养基中，30℃ 200rpm摇床培养10小时至对数生长期
取5ml培养液3000 rpm离心5 min，弃上清，TE（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0）洗涤两次
加入500μl裂解混合液（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0；1% SDS），65℃水浴30min。3000rpm离心5min，吸取上清
加入等体积缓冲液（苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1），混匀，12000rpm离心10min，取上清，重复两到三次直到分界层没有白色蛋白质

回收上清液加入两倍体积的无水乙醇（异丙醇），-20℃静置20～30 min，12000rpm离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤一次

自然干燥后溶于100μl的TE中，加1％ 10mg/ml的RNA酶A的母液（10mg/mL，上海生工），37℃水浴处理30min后备用。

可以用lyticase，我用的tiangen的，3000个单位的包装才150元。我是提RNA，根据promega sv total rna isolation 里要求的破壁方法，
1、将适量酵母于合适培养基、合适温度培养过夜，第二天，将培养物用同样培养基按1：50稀释后继续培养，直到OD600达到0.6-1.0，这一般需要短短几小时。（测酵母数，我得一份量为2×10^7次方，如果你的量大，按比例加入下列裂解液）
2、14000g离心2min。
3、将离心得到的沉淀溶解于100ul溶液（高压灭菌即可）中：
组成：1M 山梨醇
0.1M EDTA(Ph 7.4)
在使用前加入0.1%巯基乙醇和50个单位的lyticase。(0.1%是体积比)
4、在30℃孵育15-30min直到溶液变为澄清。(我的是20分钟虽然不是特别澄清，但是镜检大约90%都已经变成原生质体了)
效果还是不错的，你可以试试啊，如果不行的话可以考虑加大lyticase的量或者孵育时间。

用酸洗玻璃珠试试呢？用蜗牛酶试看看呢？有的公司好像有酵母细胞专用的裂解液买，你可以了解一下。
我想你还可以加液氮研磨试试，提细胞RNA时用到的方法。

哦，谢谢泥！因为想提取物质，所以不想引入太多的杂质。用酸洗玻璃珠怎么操作呢，加入后剧烈振荡就可以吗？如果用液氮是不是要尽量使样品干燥，可是发酵得到的酵母泥稀稀的，恐怕不好磨哦。

酸性玻璃珠法主要是用来提取DNA的时候使用，要求玻璃珠的直径约为500微米，sigma有售，不过价格较高。如果楼主是用来提取蛋白及其他活性物质的话建议还是使用高压细胞破碎机，它的原理是利用高压使细胞破碎，不会引入其他杂质，很多企业利用酵母表达的商业用酶都过来用我们这套系统来做破碎，效果不错。

我也看到很多是用那种仪器，不过我们这儿好像没有，贵吗？你是哪里呢？

liuyujia
哦，谢谢泥！因为想提取物质，所以不想引入太多的杂质。用酸洗玻璃珠怎么操作呢，加入后剧烈振荡就可以吗？如果用液氮是不是要尽量使样品干燥，可是发酵得到的酵母泥稀稀的，恐怕不好磨哦。

‘如果用液氮是不是要尽量使样品干燥，可是发酵得到的酵母泥稀稀的，恐怕不好磨哦”，嘿嘿，这个不用担心，你的酵母泥稀稀在倒入液氮后就会变得如铁石般硬。
一般我们操作时是把液氮先倒入一个大研钵，再把“酵母泥稀稀”滴加到里面，会形成小颗粒和絮状凝固物。然后再研磨。呵呵，研磨过程中可以多次添加液氮，，液氮挥发干时再研磨，重复三四次就OK了。
试试，嘿嘿

那就这样磨磨我的“酵母泥稀稀”试试吧，呵呵。。。。谢谢！

楼主，我正在提酵母中的dna呢，呵呵。同志啊
提了两天了，还没有成功。
前天大提了一次，最后竟然一点也没有。然后昨天我把前天大题离心下来的菌体再重新破壁了1个小时，然后就提出来了。但量太少了，等除了rna后竟然又消失了，郁闷
今天有提了一下，破壁3个小时，提取不出来，现在在提破壁6小时的，希望一会儿能提出来。
同时现在大题破壁，准备过夜破壁，明天接着提。

估计是破壁不成功，需要很长时间破壁才成。

下面是我的提取流程，仅供参考，呵呵

接种C18和C19于25 ml的YEPD液体培养基中，30℃ 200rpm摇床培养10小时至对数生长期
取5ml培养液3000 rpm离心5 min，弃上清，TE（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0）洗涤两次
加入500μl裂解混合液（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0；1% SDS），65℃水浴30min。3000rpm离心5min，吸取上清
加入等体积缓冲液（苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1），混匀，12000rpm离心10min，取上清，重复两到三次直到分界层没有白色蛋白质

回收上清液加入两倍体积的无水乙醇（异丙醇），-20℃静置20～30 min，12000rpm离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤一次

自然干燥后溶于100μl的TE中，加1％ 10mg/ml的RNA酶A的母液（10mg/mL，上海生工），37℃水浴处理30min后备用。

纯培养酵母菌的少量基因组DNA的提取可以使用反复冻融法，比较省时省力。我使用该方法对于DGGE已经足够了；另外，如果经费允许，可以使用试剂盒，国产的也不贵，50次的500元左右吧。