[求助] 氯化铯纯化腺病毒...

[求助] 氯化铯纯化腺病毒

各位xdjm，我在做腺病毒的纯化，用的是氯化铯密度梯度离心法，遇到了一些问题，急盼指点！不胜感激！
1、氯化铯的配制方法，如配制1.1g/ml、1.3g/ml和1.4g/ml的氯化铯应该是怎样配制呢？比例如何，是用tris－Hcl直接稀释呢，还是先配成饱和状态呢？
2、氯化铯纯化腺病毒以后，是用什么样的透析袋呢？一般孔径的可不可以啊？腺病毒的直径大约90nm。
再次谢过！！

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hys
我说的是扩增过程中收集培养基中的腺病毒，不是包装。

我觉得收集腺病毒时的滴度跟你收集时机有关系，因为传统的收毒方式是只收集细胞的，倘若是等所有病毒都飘起来再收集，可能滴度会很低，因为部分细胞已经裂解，病毒都已经释放到培养基当中了。所以若只收集细胞，最好的收毒时机是等几乎所有细胞变圆，一半细胞飘起来是收集最好。

而下面这篇文献提到的是用硫酸铵沉淀法收集培养基中的腺病毒，我反正是现在连培养基也一起收了。

......

收毒的时机很重要。一般来说不需要观察到细胞漂浮。收集病毒流程如下：
1。 转染骨架进入293。大约1个星期左右，收集上清，细胞分开收集，－80保存
2。将上清感染另一板细胞；8小时收集上清（绝对不要超过12小时）。细胞分开收集，－80保存

3。重复2步3次。此次上清病毒量已经是1步中的10倍以上了
4。用此上清感染3板细胞，6－8小时收集上清
5。 用4步上清感染20板细胞，6小时收集细胞，－80保存，上清收集再感染20板细胞，同样收集细胞保存，此上清再感染20板细胞，直至80至100板细胞。
6。将所有的细胞集中起来，裂解后就可以纯化了。

无菌的问题不需要困扰，在重金属中什么细菌都生存不了。至于保存液也可以不用甘油，请搜索其他战友帖子。

楼上的你错了。氯化铯不原始！只要你技术到家，设备可靠，它获得的滴度与纯度远远好过你所谓的其他先进方法。（例如，滤膜结合法）用滤膜获得的病毒质量并不高，很多病毒碎片，影响滴度的计算。如果你有能力做氯化铯，我建议还是用氯化铯。

做腺病毒不需要3个梯度。两个足以。

现给楼主附上配方：
CsCl discontinuous gradients
CsCl1.4mg/ml 53g CsCl + 87ml 10mM Tris-HCl (PH 7.9)
CsCl1.2mg/ml 26.8g CsCl +92ml 10M Tris-HCL (PH 7.9)
3.5ml 1.2CsCL+ 3.5ml 1.4CsCl + 4ml Sample(11ml)
100000g (35000rpm)2~3h
4~10decleration=0

Viral stock buffer:
20mM Tris-HCl PH 8.0
25mM NaCl
2.5% Glycerol

保证可用，呵呵！！

后面一个问题解决了，文献上说腺病毒的分子量很大，因为一般是4万个bp，所以一般的透析袋都不会漏出去，应用3000道尔顿到25000道尔顿的透析袋都可以，第一个问题尚待解决，多谢啦！

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zehui_2005
各位xdjm，我在做腺病毒的纯化，用的是氯化铯密度梯度离心法，遇到了一些问题，急盼指点！不胜感激！
1、氯化铯的配制方法，如配制1.1g/ml、1.3g/ml和1.4g/ml的氯化铯应该是怎样配制呢？比例如何，是用tris－Hcl直接稀释呢，还是先配成饱和状态呢？
2、氯化铯纯化腺病毒以后，是用什么样的透析袋呢？一般孔径的可不可以啊？腺病毒的直径大约90nm。
再次谢过！！

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为什么用氯化铯法呢？太原始了。

楼上的你错了。氯化铯不原始！只要你技术到家，设备可靠，它获得的滴度与纯度远远好过你所谓的其他先进方法。（例如，滤膜结合法）用滤膜获得的病毒质量并不高，很多病毒碎片，影响滴度的计算。如果你有能力做氯化铯，我建议还是用氯化铯。

做腺病毒不需要3个梯度。两个足以。

现给楼主附上配方：
CsCl discontinuous gradients
CsCl1.4mg/ml 53g CsCl + 87ml 10mM Tris-HCl (PH 7.9)
CsCl1.2mg/ml 26.8g CsCl +92ml 10M Tris-HCL (PH 7.9)
3.5ml 1.2CsCL+ 3.5ml 1.4CsCl + 4ml Sample(11ml)
100000g (35000rpm)2~3h
4~10decleration=0

Viral stock buffer:
20mM Tris-HCl PH 8.0
25mM NaCl
2.5% Glycerol

保证可用，呵呵！！

腺病毒CsCl纯化用1.2和1.4，配CsCl时要测比重的，如果没有仪器，最简单的办法，用eppendrof tube装1ml H2O, 使其正好是1g,然后调整你的溶液分别和水一样体积的是1.2和1.4。
第一次72000xg 2hr把中间白色的band(腺病毒）取出来，要再离心一次72000xg ON,。透析用分子量100000的，透析液：tris 4.84g, Mgcl2 1.62g, sucrose 200g 4L, 4hr 一次，2次。

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gexiaohu
楼上的你错了。氯化铯不原始！只要你技术到家，设备可靠，它获得的滴度与纯度远远好过你所谓的其他先进方法。（例如，滤膜结合法）用滤膜获得的病毒质量并不高，很多病毒碎片，影响滴度的计算。如果你有能力做氯化铯，我建议还是用氯化铯。

做腺病毒不需要3个梯度。两个足以。

现给楼主附上配方：
CsCl discontinuous gradients
CsCl1.4mg/ml 53g CsCl + 87ml 10mM Tris-HCl (PH 7.9)
CsCl1.2mg/ml 26.8g CsCl +92ml 10M Tris-HCL (PH 7.9)
3.5ml 1.2CsCL+ 3.5ml 1.4CsCl + 4ml Sample(11ml)
100000g (35000rpm)2~3h
4~10decleration=0

Viral stock buffer:
20mM Tris-HCl PH 8.0
25mM NaCl
2.5% Glycerol

保证可用，呵呵！！

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想请教gexiaohu几个问题：
1。打动物时是不是不能加甘油，因为它比较粘稠，会增加注射的难度
2。离心管顶层是不是还要加什么矿物油呢

呵呵，谢谢gexiaohu战友的热心帮助，我现在已经做完了氯化铯离心，电镜观察得到的病毒还可以，滴度也在10的11次方左右，感觉不连续的梯度离心法效果还是不错的。有其他的方法固然好，但是经费有限，还是用最经济实用的吧。

我问过发明腺病毒表达载体得专家He T.C.他们也是通过CsCl梯度离心得办法纯化DNA，所以这个方法还说不上原始