cDNA文库的筛选鉴定...

cDNA文库的筛选鉴定

1 核酸杂交
是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.
1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.
2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.
3)总cDNA探针:
通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.
cDNA扣除探针:
从第一种mRNA制备cDNA探 针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;
回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.
* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.
5)合成寡核苷酸探针
2 特异性免疫学检测
在cDNA表达文库中,目的基因的表达产 物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测
3 cDNA克隆的同胞检测
将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.
4 cDNA克隆的确证
cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.
第四节 目的基因的分离
外源基因:
插入到载体内的那个特定的片段基因.
目的基因:
那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段.