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【旧帖整理】miRNA、siRNA、RNA干扰原理，步骤及相关问题总结！有问题的也可以提，共同交流讨论！[精华]

4. siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。

谢谢楼主

补充点！

首先外源性或细胞内源性的dsRNA与胞内的RNAi核酸酶(如Dicer)相结合,之后dsRNA被RNAi核酸酶切割成21～23nt的小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA) ,此siRNA含有2 ～3nt的3′突出端,被输送到RISC (RNA-in-duced silencing protein complex) , siRNA 作为引导序列引导RISC与同源性的mRNA结合,解旋酶催化mRNA与siRNA的正义RNA链相互交换, siRNA的反义链与同源mRNA结合后,核酸酶在mRNA与siRNA反义链所形成的双链区的5′起始端下游7～10个核苷酸处(也就是双链区的靠近中间位置)切断mRNA,降解的mRNA被释放后, siRNA双链重
新形成,可以继续降解同源的mRNA

希望有做这方面的战友，多多发表心得！

有没有人用病毒做载体进行RNAi的呢？我现在是菜鸟，有很多问题想请教大家。

4. siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。

想请教一个问题，VIGS毕竟是利用病毒来做载体的，我是做观赏植物RNAi的，这样不会对植物产生很大的影响吗？就算试验最后成功了，我育出的品种也没什么价值呀，因为它本身就是带病毒的，没法推广。

有时间认真学习一下，呵呵

受益良多！

喜欢，谢谢了