pet28构建表达载体发生自连？...

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pet28构建表达载体发生自连？

mpark

举报 2017-08-10 21:01

How is the 240 bp insert DNA generated?

徐鹏程2QTW

举报 2017-08-12 06:02

刘昊QC8B
构建后双酶切验证，发现载体变的超大5000多变成了8000以上，切出来的片段也不对，我的是240bp的切出来1000多，还特别暗。大家有遇到这个问题么？电泳marker右边第一个是对照空载体。

你可以用载体的通用引物做菌液pcr，不需要做酶切

刘昊QC8B

举报 2017-08-06 12:15

mpark
How is the 240 bp insert DNA generated?

是用pcr出来的，设计的双酶切引物，pcr后试剂盒纯化然后双酶切，试剂盒纯化，然后t4连接酶连接。

刘昊QC8B

举报 2017-08-10 21:04

徐鹏程2QTW

你可以用载体的通用引物做菌液pcr，不需要做酶切

我是用的自己引物菌液pcr都出来了，然后去测序不对然后提质粒验证了一下，不对。

mpark

举报 2017-08-14 09:55

The 420 bp PCR fragment can be blunt ended and then using blunt ending ligation to clone into pUC or pBlueScript first. After screening and sequencing confirmation, cut off the insert and clone into pET28.

刘昊QC8B

举报 2017-08-09 04:40

mpark
The 420 bp PCR fragment can be blunt ended and then using blunt ending ligation to clone into pUC or pBlueScript first. After screening and sequencing confirmation, cut off the insert and clone into pET28.

thank you 我今天做了新的酶切并且用切之前的做了对照发现pet28b切之后的大小变得很大得8000以上而对照是5000多正常的，是不是我酶切的问题啊？