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收藏  |   举报 2008-05-28 10:01   关注：205   回答：12

【求助】RNA干扰载体连接...

已解决 悬赏分：0 - 解决时间 2025-01-10 06:29
【求助】RNA干扰载体连接
举报 2008-06-07 01:59

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anlong
急啊！我用别人已经插入目的片段的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen质粒做了双酶切（EcoRⅠ和 BamH Ⅰ)，然后连自己的目的片段，快做了一个月了，一直长不出单克隆来，郁闷

目的片段是自己设计合成的两条寡核苷酸链退火得到的，条件是100μM的单链各1μl，补8μl水至10μl体系，95° 30S, 72°2min，37° 2min,25° 2min, 4° 30min。（因为片段只有60多个BP，而且是合成的，所以量少，不好鉴定是否退火成功。。）

连接用的是TAKARA的Solution Ⅰ溶液，连接时间从3小时到过夜都试过，16°

我怕shRNA单链发卡结构太严重，甚至试了下DMSO，但还是不成，实在找不出原因了，哪位大虾帮我看看啊，感激不尽！！！

......



跑PAGE胶看看引物质量以及退火效率。
举报 2008-05-30 01:09
刚跑了个琼脂糖电泳，100以下倒是有带，但已经很模糊了，没法判断多大，可以确定是退火产物么？
如果没有形成双链应该不显色吧
举报 2008-06-06 22:33
我们自己也做过很多个质粒了，感觉一般片段退火这一步没啥问题。建议首先排除你载体的问题，如载体是否正确，酶切位点选择是否合理，载体回收后的可用于连接的活性（找个从其它载体上切下来的片段作为连接的阳性对照试试）。
举报 2008-05-31 05:50
hehwei
我们自己也做过很多个质粒了，感觉一般片段退火这一步没啥问题。建议首先排除你载体的问题，如载体是否正确，酶切位点选择是否合理，载体回收后的可用于连接的活性（找个从其它载体上切下来的片段作为连接的阳性对照试试）。

恩，谢谢，我试试看
举报 2008-06-07 12:05
做的怎么样了？？？？
举报 2008-06-04 16:13
能把载体单酶切和双酶切的电泳图放上来吗
举报 2008-05-30 08:08
丁香海豚
做的怎么样了？？？？

还是没进展，小片段大载体就这么难连吗？你的实验怎么样了？
举报 2008-06-07 07:12
snooppyyy
能把载体单酶切和双酶切的电泳图放上来吗

因为载体6600bp,片段60个Bp,所以切出来单切和双切看着一样大，但单切都能切开，我估计切好的载体应该没什么问题吧
图当时没有保存
举报 2008-05-31 15:27
anlong
还是没进展，小片段大载体就这么难连吗？你的实验怎么样了？


我从新做批感受态，估计是它出了问题，
今天又重新退火了一批oligo，
今天晚上再连~
我就不信，做不出来
你也别灰心~
举报 2008-05-28 17:02
要验证感受态你转个带抗性的未切质粒就可以了
我再换个大点的插入片段试试。
一起加油吧
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