【讨论】屎肠球菌基因敲除技术，如何构建重组载体？...

【讨论】屎肠球菌基因敲除技术，如何构建重组载体？

很成熟的手段了。找一篇学生毕业论文，照葫芦画瓢即可~
最好能找到实验室，直接要质粒~~~

blowapc
很成熟的手段了。找一篇学生毕业论文，照葫芦画瓢即可~
最好能找到实验室，直接要质粒~~~

谢谢！课题组之前用pTX4577构建过重组自杀质粒，制备感受态，转化是通过电转化，可成功制备目的基因突变株，但是效率太低，所以想问问，除了这个方法之外，还有没有更有效率的方法。

kajunin
谢谢！课题组之前用pTX4577构建过重组自杀质粒，制备感受态，转化是通过电转化，可成功制备目的基因突变株，但是效率太低，所以想问问，除了这个方法之外，还有没有更有效率的方法。

做突变这个技术，本身效率就不高……否则就像PCR一样泛滥了……
只能根据自己菌的条件，摸索一些提高效率的方法，当然，一般来讲，不会有质的变化，顶多是更稳定而已。等你在这个菌上面做了十年八年，或许才能找到一些窍门。

blowapc
做突变这个技术，本身效率就不高……否则就像PCR一样泛滥了……
只能根据自己菌的条件，摸索一些提高效率的方法，当然，一般来讲，不会有质的变化，顶多是更稳定而已。等你在这个菌上面做了十年八年，或许才能找到一些窍门。

恩，明白了，我还是踏踏实实地开始做吧，感谢有你！过程当中若是有疑问，还望不吝赐教！哈哈！

blowapc
做突变这个技术，本身效率就不高……否则就像PCR一样泛滥了……
只能根据自己菌的条件，摸索一些提高效率的方法，当然，一般来讲，不会有质的变化，顶多是更稳定而已。等你在这个菌上面做了十年八年，或许才能找到一些窍门。

我将我的一些实验细节贴于此，你如果空的话，帮我看看其中哪些环节需要注意：用KpnI+SalI酶将pTEX4577切开，目的基因扩增后，用KpnI+SalI将目的基因片段连与上述切开的质粒，得到连接产物；将连接产物加入到由Top10F’菌制成的感受态中，得到重组细菌，进行自杀质粒的提取，后行酶切、PCR、Sequencing等鉴定，成功后用于后续实验；一系列准备工作后，将TX16感受态与上述成功的自杀质粒进行转化，电转化参数：用1.5kv电压持续5ms，电穿3次（既往文献报道），得到突变株。经PCR、PFGE、Southern鉴定后行生长曲线及稳定性鉴定；
这是构建突变株实验思路，因为本人没有做过，为了避免少走弯路，请问需要注意哪些细节？

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kajunin
我将我的一些实验细节贴于此，你如果空的话，帮我看看其中哪些环节需要注意：用KpnI+SalI酶将pTEX4577切开，目的基因扩增后，用KpnI+SalI将目的基因片段连与上述切开的质粒，得到连接产物；将连接产物加入到由Top10F’菌制成的感受态中，得到重组细菌，进行自杀质粒的提取，后行酶切、PCR、Sequencing等鉴定，成功后用于后续实验；一系列准备工作后，将TX16感受态与上述成功的自杀质粒进行转化，电转化参数：用1.5kv电压持续5ms，电穿3次（既往文献报道），得到突变株。经PCR、PFGE、Southern鉴定后行生长曲线及稳定性鉴定；
这是构建突变株实验思路，因为本人没有做过，为了避免少走弯路，请问需要注意哪些细节？

......

你做的是插入失活吧？不太了解你这个质粒啊！上面是否携带自杀基因呢？我只做过G-， 对G+没有什么了解~
TX16是你的肠球菌吧？我猜除了这一步电转化，其他步骤应该都不是问题。在G-里面，这一步很多情况下可以用结合来替代。

blowapc
你做的是插入失活吧？不太了解你这个质粒啊！上面是否携带自杀基因呢？我只做过G-， 对G+没有什么了解~
TX16是你的肠球菌吧？我猜除了这一步电转化，其他步骤应该都不是问题。在G-里面，这一步很多情况下可以用结合来替代。

恩，是插入失活，失活的标记基因是一个我们实验路线中要探讨的拟毒力基因; pTEX4577是带有卡那霉素抗性的大质粒，TX16是屎肠球菌（用于毒力及耐药常用菌），肠球菌尤其是屎肠球菌对多种抗菌药物天然耐药，所以pTEX4577是较常用的筛选质粒，大质粒pTEX4577经酶切后连接了我们拟失活的目的基因片段后，构建成了针对目的基因的自杀质粒; 我也问过一些做此相关的人员，他们评估了此环节的耗时大概在半年左右，且成功者廖廖，屎肠球菌难度一在自杀质粒难以构建，二在转化效率奇低，课题组曾经有前辈做的脑壳都大了，所以向您及有经验的同仁咨询，集思广益，寻求更有效率的方式。

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kajunin
恩，是插入失活，失活的标记基因是一个我们实验路线中要探讨的拟毒力基因; pTEX4577是带有卡那霉素抗性的大质粒，TX16是屎肠球菌（用于毒力及耐药常用菌），肠球菌尤其是屎肠球菌对多种抗菌药物天然耐药，所以pTEX4577是较常用的筛选质粒，大质粒pTEX4577经酶切后连接了我们拟失活的目的基因片段后，构建成了针对目的基因的自杀质粒; 我也问过一些做此相关的人员，他们评估了此环节的耗时大概在半年左右，且成功者廖廖，屎肠球菌难度一在自杀质粒难以构建，二在转化效率奇低，课题组曾经有前辈做的脑壳都大了，所以向您及有经验的同仁咨询，集思广益，寻求更有效率的方式。

......

质粒可以借鉴前人的基础，这个应该不难搞，只要抗性选好了，其他都不是什么难点。
我认为，最难的就是遗传转化体系。我们在G-中已经放弃了电击转化这种方式，效率实在太低。质粒进入细菌以后，还需要发生一次同源重组，这些都是在电击转化及其恢复培养的过程中实现的。在G-中，我们一般通过结合转移方式来进行。

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blowapc
质粒可以借鉴前人的基础，这个应该不难搞，只要抗性选好了，其他都不是什么难点。
我认为，最难的就是遗传转化体系。我们在G-中已经放弃了电击转化这种方式，效率实在太低。质粒进入细菌以后，还需要发生一次同源重组，这些都是在电击转化及其恢复培养的过程中实现的。在G-中，我们一般通过结合转移方式来进行。

......

恩，是的，我也涉猎了一些这方面的知识，本来是打算弄得很明白再开始，现在想想，还是在进程中不断摸索吧，想法再多，考虑再周全，也要在应用中不断去完善自己的知识体系及操作规范，所以，我要开始喽，哈哈，谢谢你！