【求助】载体构建后，报告基因不发光，急急急！！！...

【求助】载体构建后，报告基因不发光，急急急！！！

如果载体构建和转染都确信没有问题的话,可能有两种原因:

1. 导入的目的基因翻译效率太低,导致整个融合蛋白水平低.这是有可能的,因为根据你的描述,该启动子介导的转录是没有问题的(空载体连上启动子后有荧光),但加入目的基因后导致翻译水平急剧下降.所以检查一下目的基因起始密码子ATG前是否加入了kozak序列,正如载体原先dsRed ATG之前的GCCACC序列,有时候的确会影响翻译.这也说明了一点,做融合蛋白最好把dsRed放在目的基因前面,因为商品化的载体一般都已经优化好了翻译必须的一些元件.

2. 导入的目的基因是有细胞毒作用的,表达蛋白的细胞都死了.

1，先做western 确定你的目的蛋白是否表达。如果目的蛋白都不表达，那荧光无从谈起。这个得从载体 启动子 基因宿主细胞等方面找原因，麻烦得很。
2，红色荧光表达比较慢，至少得48小时以后，而且荧光蛋白在蛋白C端，要比空载时弱得多，在较弱启动子下，更弱了。
3，有时是要加柔性片段，4个连续的（Gly4Ser)。
4，如果有文献，完全按文献来。有的文献构建不加 kozak 不加柔性片段 照样表达得不错。

顶一下让高手看到

你的目的基因有剔除终止密码子么？如果没有的话，下游的报告基因是不转录的，看你的载体上好像只有一个启动子。

To：calvinwj
谢谢您的回答。是的，我的载体只有一个启动子。但是目的基因的终止子是被剔除了的。但是还是不发光。就不知道是什么原因。
继续请各位高手指点。

From the DNA sequence you have shown there is no any ATG codon in your inserted fragment.The inserted fragment may even cause no translation or low translation of the downstream DsRed2 gene if it is transcribed.

To:mpark
首先感谢您的答复，ATG密码子用的是目的基因的ATG密码子。
继续求助。

Run Western blot to probe if there is any GFP protein expressed. You can also probe your cell extracts with antibody against gene product you are studying in the Western blot.

Hi savid888

Did you add two nt or (3n + 2 nt) after the foreign gene? If not there is a problem. The reading frame will be shifted so of course, no expression of the reporter can be detected.

If you did have the additional 2 nt. Well, what does the reporter gene do? One is perhaps tell you where your target protein is by the fusion nature. Another is to tell you if you have target protein expressed or not by looking at the signal of the reporter. So if the cell does not express the target protein for any reason (toxicity, for example), you will not see the luminescence (fluorescence?) from the reporter.

Your control experiment is a good one to rule out that whatever negative results you got is not because of the transfection, etc.

good luck

我也认同amberly的观点，因为是融合表达，你需要Check下报告基因的阅读框架有没有受到影响