siRNA转染整理总结...

转染率的测定只能靠荧光和PCR么，转染效率要达到多少才能符合一般实验要求有确切定论么？目前正在尝试联系文献作者进一步了解该环节的细节。

其次我做RNAi准备用的是esiRNA，查资料好像比siRNA沉默率更高些。产品介绍中有详细esiRNA cDNA target sequence,而原蛋白编码基因尚无从获知。个人角度考虑怎样能保证esiRNA质量，怎样确保esiRNA有效可行？沉默率只能靠western和蛋白吸光度检测？沉默率达到多少能取得预期western结果（即证明蛋白表达差异有意义）？

现如今主要是如何证明该方案的可行性并确保较高成功率，说服老板松口，真正开始进行实验。

小白一只，摸石头过河，还望不吝赐教！

想请问一下有没有使用了siRNA之后反而目的基因上调的情况，我们实验室最近有几例这种情况发生，不知道是哪里出了问题，是siRNA序列的问题吗？如果敲减不了应该是敲减效率不高，为什么反而会上调呢？

下面进行自己的关于siRNA转染的想法。

一首先是siRNA的设计

关于siRNA设计最好的办法是交给公司免费设计，公司会根据你的目的基因序列设计针对靶序列的3条siRNA，能够保证的是3条siRNA里至少有一条效率是高的。我们只需要从3条siRNA序列里筛选出沉默效率最高的那条siRNA进行下游实验即可。

也可以根据公司主页上的在线设计siRNA网站进行siRNA设计。

这样的公司网站有很多。

如invitrogen公司

https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do

Genscript公司

https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai

SiDesigner center

http;//www.dharmacon.com/

1最后再次给大家介绍个比较好的siRNA设计网站。Sfold软件

网址http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl

界面如下图

其设计siRNA主要根据靶的可接近性预测（target accessibility evalution）

一些经验规则和标准的设计规则，如AAAA，TTTT序列应避免，转录的终止信号。GGG，CCC序列应避免，能够形成四聚体并干扰RNAi等。

一些热力学性质，RNA的二级结构的预测等。感兴趣的可以交流下。

二。siRNA的转染效率

1.转染效率的高低首先跟你的细胞的类型有很大的关系。

这个帖子可以参考下细胞转染相关简述 - 蚂蚁淘论坛

一般情况下，对于神经细胞和一些原代细胞加上悬浮细胞来说，其转染效率都是相对较低的。当然也有一些细胞系也是很难转的。所以对于想做转染的战友来说。在开始进行转染前需要明确的是你的细胞是否适合这种普通的转染方法，看看文献看看别人对于这种细胞都是采取的什么方法进行转染的。不行就要趁早使用电转或者考虑病毒转染，这些方法相对效率要高些。本人转染的原代血管内皮细胞。如果有想转染这类细胞的话可以交流下。

2.转染试剂的选择，不推荐了。

3好的细胞状态。如果细胞状态不行，细胞是不适合进行转染的。如果细胞状态不好的时候同时在使用脂质体转染试剂进行转染的时候，可能会加重转染试剂对于细胞的毒性作用。

4.细胞的密度。不同的转染试剂所需要的细胞密度是不同的。请根据转染试剂上推荐的细胞铺板密度进行细胞铺板。

5.SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化的。如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终溶度不要超过20nM吧，因为荧光信号被采集到需要一定的灵敏度的。所以一般推荐的siRNA终溶度多在50nM 。

关于siRNA的量与转染试剂的量进行优化，一般选择24孔板进行优化吧。比较节省各种试剂，一般对siRNA设计几个溶度梯度如50nM，80nM，100nM。转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动2个梯度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合从其中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。对于质粒转染也是一样的，比如质粒的量设计几个梯度如1ug,2ug等。进行组合即可。比值一般在1/2到1/8间进行优化吧。这个是很重要的。

6用于稀释siRNA与转染试剂的无血清培养基。这里是推荐thermo公司的opti-MEM培养基的。能够提高细胞的转染效率的，尤其是在进行脂质体转染的时候是会很大程度上较少细胞毒性作用。7.一般对于FAM标记的或者GFP等标记的siRNA转染。在转染后6h就可以确保siRNA转染进细胞了。因此一般在转染后6h即可进行转染效率的检测。方法有流式和荧光显微镜。

8如果使用荧光显微镜观察的话，在观察之前需要使用PBS洗细胞3次，放在PBS里观察拍照。这样可以洗去黏在细胞表面的没有转染进去的siRNA，同时可以排除培养基颜色对于荧光的观察。

9由于FAM荧光比较淡是没有GFP等荧光亮的，所以一般在显微镜下观察的时候我是喜欢将曝光调节到最大的。这样拍出来的荧光比较清楚。

三。siRNA沉默效率的检测

1.PCR检测mRNA水平的沉默效果，一般推荐在48h到72h检测吧。可能48h比较理想吧。需要具体的摸所时间。

2.WB检测蛋白蛋白水平的检测，一般在转染后48h到92h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟你的蛋白的半衰期有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。

3.PCR检测沉迷效果时，在设计引物的时候最好是将引物设计在沉默位点的两侧，而不是在同侧。这个是由于RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。这个可能切割和降解具有不同的时间点。即使不能设计在同侧，也不要离沉默位点太远的地方。不然可能会造成对沉默效果的低估。

4.关于siRNA的阳性对照。如果你的实验中出现了siRNA的转染效率很高能够达到70以上，而siRNA的沉默效率始终很低的话，这个时候你需要怀疑你的siRNA的效果问题了。这个时候可以做下siRNA的阳性对照。阳性对照有actin和gapdh等。基本有针对这些基因的特异性的高效的siRNA序列。

5.关于siRNA转染后多长时间加药的处理细胞的问题。

siRNA干扰后多长时间可以加药处理？ - 蚂蚁淘论坛

这篇帖子可以帮助你。一般都是采取转染后24h开始进行药物处理细胞，不过最后还是要看你的实验的目的的.

四。siRNA体内转染

目前正在养肿瘤细胞，还没有造模，等试验结果出来后再回来分享。

五。有问题互相交流。

终于没有敏感消息了

非常感谢哦！

搜到一篇最近的文献，使用的是Lipofectamine™ RNAiMAX转染原代小胶质细胞，我准备用现成的esiRNA配合该试剂转染，不知道成功率高不高，想用western检验。而且研究蛋白的esiRNA只有一种，没有参考文献应用，还不知道质量怎么样。导师就拿转染率低这个问题卡着，主要是怕我钱也花了不出成果，进行不了就得换题了，很是舍不得啊