【原创】荧光原位杂交（FISH）探针的制备及其应用[精华]...

【原创】荧光原位杂交（FISH）探针的制备及其应用[精华]

issacfish老师，您好！
您曾经对我的回复和关于FISH知识的帖子对我有很大的启发，不过，很多方面我依然是个完全的菜鸟，

我想向您请教一些一些问题，希望您能抽空回答。
我研究的肾脏肿瘤想做染色体7、17和Y的FISH，对我来说，国内公司如金菩嘉的探针价格也不菲，我考

虑能不能自己试着做一做探针。
在我研究的肾脏肿瘤中，遗传学改变为染色体7、17的三倍体和染色体Y的缺失，因此，我考虑先试着做

一下17号染色体的着丝粒探针，查到文献中17号染色体α-卫星DNA中“16 monomer tandem repeats”中

选取其中“alpha satellite monomer 1”的166个碱基，找公司合成这166个碱基的DNA链（应该合成双

链还是单链？），然后再买一个荧光标记盒，把DNA链和荧光标记盒加在一起能做成我想要的荧光探针吗

？然后再买一个原位杂交试剂盒，按步骤在石蜡切片上进行操作。
以上就是我的设想，不知道有没有可行性，请您指教！
谢谢！

一、 概述
1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征
1914年德国遗传学家Boveri就提出染色体畸变与肿瘤起源相关，然而这还仅仅只是一个假说；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的患者中发现后来被称为费城染色体（Philadelphia chromosome）的微小染色体；1973年Rowley证实了Ph染色体是9号和22号染色体易位所致，这是人们在肿瘤中认识到的第一个染色体易位；目前，已经有11,500篇文献报道了55,600多种克隆性细胞遗传学异常。这些染色体畸变，尤其是染色体易位及其相应的融合基因在肿瘤致病的起始阶段有着重要的作用，无不说明克隆性细胞遗传学异常是肿瘤的特征，在肿瘤起源中起重要作用。

下图是各种疾病报告的克隆性染色体异常病例数

2、染色体异常的常见类型
染色体异常指数目异常和结构异常两类：前者包括整条染色体数目的扩增和缺失；后者包括染色体易位、插入、倒置、区带的缺失或扩增等。

下图是染色体数目异常

染色体结构异常

3、染色体异常的检测方法
染色体异常的识别得益于二十世纪六十年代后发展起来的胰蛋白酶－姬姆萨染色和常规显带技术，使得常规筛查全基因组染色体异常和检测染色体核型改变成为可能。染色体显带是细胞遗传学分析技术中标准和常用的方法，但耗时且依赖于获得良好的分裂相，还难于分析复杂和隐匿的异常。

PCR或荧光原位杂交（FISH，fluorescent in situ hybridization）对染色体异常的检出依赖于引物或探针与模板的结合，因此较常规显带具有更高的特异性，是高通量检测染色体异常的敏感和特异的方法。

二、 荧光原位杂交及其探针
1、荧光原位杂交的原理
染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，这种结合开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。其基础是Southern blot原理，以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。FISH具有快速灵敏、特异性好的特点，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。

The Wellcome Trust Sanger Institute（Hinxton, Cambridge）由Wellcome Trust和British Medical Research Council联合建立，是世界上较早开展人类基因组大规模测序并具有相当实力的测序中心。该中心利用能容纳大片段人类基因组DNA的高容量载体（如粘粒、BAC、PAC等）构建了大片段人类基因组DNA文库，通过文库中末端相互重叠的DNA片段连接成叠连群（contig）并与鸟枪法相结合，加快了基因组测序，实现了人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）中人类基因组的物理作图（physical mapping）和基因组测序相结合的目标。因此，这些克隆文库为基因定位研究提供了丰富的DNA 序列资源，NCBI Clone Registry（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/clone/）、Ensembl Genome Browser
（http://www.ensembl.org/index.html）和UCSC Genome Bioinformatics（http://genome.ucsc.edu/）提供的网络生物信息学资源也记载了许多克隆基因组定位的详细信息，为我们选择相应克隆为作为染色体单一序列和端粒探针的来源提供了便利。

大片段人类基因组DNA文库的构建过程

常用的BAC、PAC文库