DNA指纹图谱的产生的方法...

DNA指纹图谱的产生的方法

2.1 主要试剂及器材
产生 DNA 指纹图谱的主要试剂及器材如下：限制性内切酶 HinfⅠ、HaeⅢ等；电泳级琼
脂糖；尼龙膜；λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ；H4 型（24×20cm）水平电泳槽装置；Model 250 型
电泳仪；标记试剂盒 Prime-a-Gene® Labeling system；（α-32P）dCTP；X 光胶片；LS5801
型液闪仪；FYY-1 型多功能生化反应仪。
2.2 有关试剂的配制
（1） ACD 抗凝剂
柠檬酸 0.48g
柠檬酸钠 1.32g
葡萄糖 1.47g
加水至 100ml
（2） T10E10 缓冲液
Tris-HCl 10mmol/dm3
EDTA 10mmol/dm3
pH 值：8.0
（3）TE 缓冲液
Tris-HCl 10mmol/dm3
EDTA 1mmol/dm3
pH 值：8.0
（4）20%SDS（100ml）
SDS 20g
溶于 100ml 蒸馏水中，30℃以上贮存。
（5）USSTE 裂解液
Urea 8mmol/dm3
NaCl 0.3mol/dm3
SDS 2%
Tris-HCl 150mmol/dm3
EDTA 1mmol/dm3
pH 值：7.5
（6）Tris 饱和酚
新蒸苯酚加入 8-羟基喹啉至终浓度为 0.1%，用 1mol/dm3 Tris-HCl 和0.5mol/dm3
Tris-HCl 溶液饱和至 pH 值 8.0，去掉上层水相，加适量（约 1/10 体积）的 0.1mol/dm3 Tris-HCl
（pH 值8.0）覆盖在酚相上，保持4℃，放在棕色瓶中保存。
（7）50×TAE 缓冲液（1 000ml）
Tris 242g
冰醋酸 57.1ml
0.5mol/dm3 EDTA（pH 值 8．0） 100ml
（8）10× BPB 贮存液
聚蔗糖 20%
EDTA 0.2mol/dm3
溴酚蓝 0.25 %
二甲基腈蓝 0.25%
本贮存液可在室温存放。
（9）40mmol/dm3 亚精胺
亚精胺 0.58g
将亚精胺溶于 10ml 蒸馏水中，4℃下存放。
（10）溴化乙锭（EtBr）贮存液 （10mg/ml）
EtBr 1g
将EtBr 溶于 100ml 蒸馏水中，在棕色瓶存放，温度保持在 4℃。
（11）变性液
NaCl 1.5mol/dm3
NaOH 0.5mol/dm3
（12）20×SSC（1 000ml）
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
用 10mol/dm3 NaOH 调 pH 值至 7．0，高压灭菌。
（13）杂交液
NaPO4 0.5mol/dm3
SDS 7 %
EDTA 1mmol/dm3
（14）标记反应终止液
聚葡萄糖蓝 0.9%
溴甲酚紫 0.03%
EDTA 20mmol/dm3
4℃下存放。
（15）SephadexG-50 的水化
SephadexG-50 10g
将 SephadexG-50 溶于约 300ml TE（pH 值 8．0）中，高压灭菌，4℃下存放。
（16）闪烁液（500ml）
无水乙醇 10ml
PPO 2g
PoPoP 50mg
二甲苯 490ml
室温棕色瓶存放。
2.3 操作步骤
2.3.1 基因组DNA 的提取
（1）10ml 全血与 40mlT10E10 缓冲液混匀，4 000r/min 离心10 分钟。
（2）弃上清液，在沉淀中加入 40mlT10E10 缓冲液混匀，4 000r/min 离心 10 分钟。
（3）弃上清液，在沉淀中加入 40mlTE 缓冲液混匀，4 000r/min 离心 10 分钟。
（4）弃上清液，在沉淀中加入10mlUSSTE 裂解液，混匀呈浊液，置摇床过夜，温度保持
在37℃。
（5）加入 10ml 苯酚，缓慢上下混匀至少 20 分钟，4 500r/min 离心 20 分钟。
（6）用移液枪小心地将上层水相转移到另一离心管中，吸头的尖端剪去一小段，以免在
吸取过程中损伤大分子DNA。
（7）向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇（体积比为24:23:1），缓慢上下混匀15
分钟，4 500r/min 离心20 分钟。
（8）如前述吸出水相，向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇（23:1），上下缓慢混合10
分钟，4 500r/min 离心 20 分钟。
（9）吸出水相，向水相中加入2 倍体积的预冷（—20℃）无水乙醇，盖紧管盖，上下颠
倒即可看见白色絮状DNA。
（10）小心将絮状DNA 吸（吸头尖端剪去一小段，端部必须光滑）至1 .5ml 离心管中，加
入 1ml 70%的乙醇，来回颠倒数次离心管，10 000r/min 离心 2～5 分钟。
（11）小心地倒掉管中乙醇，将管倒置在干净的吸水纸上，以让乙醇流尽。
（12）将离心管正立，置45℃烘箱中烤20 分钟左右，以便让乙醇完全挥发掉，如有条件，
可置于真空干燥器中抽气10 分钟。
（13）取出离心管，视沉淀块的大小加入 100～200μl TE 缓冲液，置55℃水浴中过夜，以
溶解 DNA。
（14）将溶解后的 DNA 置于 4℃或—20℃下贮存。
2.3.2 基因组DNA 的酶切
（1）每样酶切反应为：
10μg DNA
1.5ml（15u） 限制性内切酶
6μl 10 倍 buffer
6μl 40mmol/dm3 亚精胺
加双蒸水至体积为60μl，用吸头混匀。
（2）37℃水浴，保持6～8 小时。
（3）取出酶切样品置于4℃下。
2.3.3 基因组DNA 酶切情况检查
（1）从每个酶切样品中取出3μl 消化液，加入3μl 2 倍BPB 混匀后点样。
（2）用 0.8%琼脂糖凝胶（内含 0.5μg/ml EtBr）和 1 倍TAE 缓冲液进行电泳，电压为60V。
（3）1 小时后，在紫外灯下检查酶切是否完全及各样品的DNA 浓度是否一致，以确保每
个样品进行电泳时上样量一致。
（4）如果发现某个样品酶切不完全，则另外加入5μl 左右的酶，在37℃条件下水浴保温6 小时。
（5）已完全酶切的样品，加入1/10 体积（6μl）的电泳上样缓冲液（10 倍BPB），混匀
后置4℃（短期）或—20℃（长期）保存。
2.3.4 大板凝胶的制备和电泳
（1）称取3.75g 琼脂糖，将其倒入一个500ml 容积的普通试剂瓶（透明度要高）中。用
蒸馏水将50 倍TAE 贮存液稀释成1 倍TAE， 量取375ml 1 倍TAE 加入瓶中， 配制的凝胶
浓度为 1.0% 。
（2）盖上瓶盖，但不能旋得太紧。将瓶放入微波炉中加热，待琼脂糖完全熔化后，溶液
是透明的。
（3）取出瓶子放在55℃的水浴箱中，约30 分钟后就能冷却至55℃。
（4）洗净并擦干制胶板（24cm ×22cm），用 2cm 左右宽的透明胶布将制胶板的两个开口
端封牢，放置在水平台面上用水平仪调平。将样品梳（ 6mm × 3mm ）插入制胶板离最近开口
端 2cm 位置。将冷却至55℃的凝胶摇匀，缓慢地倒入制胶板中央，如果有气泡出现，应用吸
头将气泡吸掉，60 分钟后，制胶板中的凝胶将完全凝固。
（5）将 50ml 50 倍 TAE 贮存液倒入电泳槽中，再加入 2 450ml 蒸馏水与其混匀，电泳槽
也应置于水平台面上。
（6）将制胶板两端的透明胶布剥离，然后将制胶板放在电泳槽的中部，小心地拔出加样
梳，以免加样孔破裂。
（7）从 4℃冰箱中取出 DNA 样品，另取两个离心管，各加入 12μl（1μg/8μl）的分子量
标志物λDNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ 及 1/10 体积的（1.2μl）10 倍 BPB，混匀。将 DNA 样品及
分子量标记物一起置于55℃水浴箱保温10 分钟，取出后立即置于冰水混和物中，2～3 分钟后
点样，这样可防止粘性末端之间的粘接。
（8）加样时每个样品用一个吸头，以免交叉污染。吸出样品后应迅速插入加样孔中下部，
轻轻推出样品，在两端加样孔中各点入分子量标志物。
（9）盖上电泳槽盖，插上导线，在加样后5 分钟接通电流，以留出时间使加样孔内的样
品通过扩散而均匀分布，将电压调至30V，电泳60 小时。
2.3.5 Southern 转移
（1）电泳结束后，将制胶板连同凝胶一起放在一个方形塑料盘中，倒入约350ml（浸没凝
胶）的 0.2mol/dm3HCl 处理 25 分钟，并每过约5 分钟摇动一次。
（2）倒掉稀盐酸溶液，加入蒸馏水简单地洗涤一下凝胶，然后倒掉蒸馏水，加入约350ml
的变性液浸泡30 分钟，间断性地摇动。
（3）倒掉变性液，加入350ml 0.5 倍变性液浸泡 25 分钟，间断性地摇动。
（4）将制胶板连同凝胶一起取出，将一块约28cm×19.5cm 的玻璃板盖在凝胶上，极其小
心地将制胶板倒翻过来，这时玻璃板在下，凝胶在上，轻轻地滑出制胶板，将玻璃板连同其
上的凝胶放在水平的桌面上。
（5）将一张20cm×19cm 的尼龙膜（注明样品排列方向及电泳方向）在0.5 倍变性液中浸
湿，然后对齐凝胶小片段区域的顶端将尼龙膜铺在凝胶的表面，用一根玻璃棒从膜的表面推
过以赶走膜与凝胶之间的气泡，用墙纸刀切除掉凝胶的无用部分（未被尼龙膜覆盖住的部
分）。操作时应戴上手套或用镊子。
（6）将3 张稍大于膜的滤纸（20cm×20cm）依次在 0.5 倍变性液中浸湿，放置在膜上，每
放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。
（7）将一打（约4～5cm 厚）已裁至滤纸大小的干吸水纸放在滤纸层上，再将一块玻璃板
放在吸水纸上，然后抓紧上下两块玻璃板迅速翻转放在水平桌面上，抽去凝胶上面的玻璃板。
（8）在凝胶的四周露出的滤纸及吸水纸上放上保鲜膜，以防止凝胶上下的滤纸直接接触。
然后将 5 张稍大于凝胶的滤纸（20cm ×20cm）依次在 0.5 倍变性液中浸湿，放置在膜上，每
放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。
（9）用一层保鲜膜将整个转移装置围盖住，以防水分蒸发，将一块玻璃板压在顶部。
（10）持续转移3～4 小时后，去掉上面的滤纸和凝胶，取下尼龙膜放在2 倍SSC 中浸泡
20 分钟，间断性摇动，然后取出放在一张干净的滤纸上，置60℃烘箱中烘30 分钟，使DNA
固定于尼龙膜上。
（11）将烤干的膜夹在两张干燥滤纸之间，置于室温下保存待用。
2.3.6 探针的标记
（1）将80ng 探针DNA（体积<30μl）倒进一个新的0.5ml 离心管中，在沸水中煮5～10
分钟，取出，插入碎冰中。
（2）然后依次在试管中加入下列成分：10μl 5 倍标记缓冲液（含随机引物），2μl BSA
（10mg/ml），2μl dATP、dGTP、dTTP 等量混合物（浓度为各 20μmol/dm3）；30μl 灭菌蒸馏
水，50μl（α-32P）dCTP（10μCi/μl，3 000Ci/mmol）（至浓度为 333nmol/dm3）；lμl Klenow
酶（3u/μl）；最后体积为 50μl。
（3）将全部试剂混匀后置37℃保温壶中保温6 小时。
（4）加入等体积（50μl）的标记反应终止液终止反应。
2.3.7 未掺入核苷酸前体的除去
（1）取一0.5ml 离心管，在管底部打一小孔，用玻璃棉塞住小孔，外套一个1.5ml 离心
管。
（2）向0.5ml 的管中加满TE 饱和的Sephadex G-50。
（3）3 000r/min 离心 5 秒钟，重新加满Sephadex G-50 后再离心，直到 Sephadex G-50
加满0.5ml 小管的3/4。
（4）将标记反应液加入 0.5ml 管中，3 000r/min 离心数秒钟。
（5）将1.5ml 管中的液体（蓝色）移入另一1.5ml 离心管中。
（6）向0.5ml 管中加入 40μl TE，3 000r/min 离心数秒钟。
（7）重复（5）、（6）步骤2～3 次，直到凝胶中的紫色即将到达0.5ml 管底部。
（8）将回收的探针置于4℃下待用。
2.3.8 探针放射性强度的测定
（1）取两个液闪瓶，各加2ml 闪烁液。
（2）在其中一个液闪瓶内加入2μl 原标记反应液。
（3）在另一个液闪瓶内加人2μl 去除了未掺入核苷酸的回收液。
（4）将2 个液闪瓶置于液闪仪中，测定其cpm。
2.3.9 Southern 杂交
（1）将 25ml 杂交液放入方形塑料盒中，于 55℃下预热。
（2）将待杂交的膜和杂交液一起放入水浴摇床中。
（3）在55℃下预杂交1.5 小时左右。
（4）将放射性探针放在沸水中5 分钟，取出后迅速插入冰水中。
（5）在杂交液中按5×105cpm/ml 的浓度加入变性的探针。
（6）在55℃下杂交约15 小时。
（7）将杂交液中的膜取出，放入1 倍SSC 溶液中于55℃下漂洗10 分钟。
（8）倒去1 倍SSC 溶液，在55℃下用1 倍SSC 溶液及0.1 %SDS 洗脱液漂洗40 分钟。
（9）倒去洗脱液，55℃下用新的1 倍SSC 溶液及0.l%SDS 洗脱液漂洗30 分钟。
（10）将膜放入1 倍SSC 溶液中，于室温下漂洗10 分钟。
（11）取出膜，平摊在洁净、干燥的滤纸上。
（12）当膜上无水珠、膜仍湿润时，用保鲜膜将膜包好准备压片。
2.3.10 放射自显影
（1）在暗室或微弱安全光条件下，打开X 光曝光暗盒。
（2）放入一张增感屏，光滑面朝上。
（3）将膜放在增感屏上（膜与膜之间不能重叠）。
（4）置X 光胶片于膜上。
（5）将另一张增感屏光滑面朝下放在X 光胶片上。
（6）盖紧X 光暗盒，置—70℃冰箱内曝光1～7 天。
2.3.11 X 光胶片的冲洗
（1）显影：将X 光胶片从暗盒中取出，放入显影液中，间断性摇动数分钟。
（2）停显影：将X 光胶片放入1.5%的冰醋酸溶液中漂洗数秒钟。
（3）定影：将X 光胶片转入定影液中定影数分钟。
（4）冲洗：将定影完毕的X 光胶片放在流水中冲洗20 分钟，然后晾干。
2.3.12 放射性探针的除去
（1）将300～500ml 蒸馏水煮沸。
（2）往蒸馏水中加SDS，至最终浓度0.l%。
（3）将放射自显影后的膜浸入其中。
（4）待冷却至室温时将膜取出、烘干，即可用于另一种探针的杂交。向左转|向右转