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2017-10-13 03:23
一、活细胞成像系统原理
目前主流的活细胞成像系统从原理上可以分为两大类： 基于宽场反卷积技术 基于共聚焦技术 两种技术作为目前最流行的活细胞成像技术，均可以实现在维持细胞存活的情况下，快速获取单一焦平面的信号，在具体性能上则各有擅长。 宽场反卷积技术 对光线进行反卷积运算是光学成像领域的成熟技术，最早由美国国家航空航天局开发并成为观察微弱天体信号的标准技术。去卷积和共聚焦技术是光学显微镜领域获得单一焦平面光线的两大主流技术(J.M.Murray， live cell imaging， 2010)。通过将非焦平面的光线还原至焦平面上，大大提高了样品信号的强度以及图像的信噪比。由于去卷积技术设计到大量的后期运算，因此在高性能计算机发明以前，一直受制于运算能力，没有得到大规模的推广。随着近年来计算机性能的大幅提升和价格的下降，去卷积技术逐渐成为光学显微镜的主流技术。一个点光源经过显微镜的光路，由于镜片对光线的衍射和散射，最终呈现在观察者面前的是一个模糊的点，所以点光源变成模糊的点的过程即为卷积。反卷积就是把模糊的点还原成点光源的过程。 以API 公司的DeltaVision 系统为例，其反卷积过程经历以下几步： 1)首先通过无数的计算和实验，得到点光源经过显微镜物镜后变模糊的规律，建立模型。 2)选择完美的物镜，保证样品信号经过物镜后变模糊的规律符合步骤一中得到的模型。 3)将通过显微镜光路的所有的光信号进行收集，因为点光源经过显微镜光路后会变成一个空间中的倒圆锥形，所以在收集信号的时候需要很准确的记录信号的Z 轴信息。 4)对收集到的所有光信号按照步骤一中的模型进行还原，最终将模糊的点还原成清晰的点，客观反映它在空间的位置和强度。 目前去卷积技术越来越广泛地应用于生物学图像的研究中。 共聚焦技术 共聚焦显微镜它采用点光源(point lightsource) 照射标本，在焦平面上形成了一个轮廓分明的小的光点(light spot ) ，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到探测器。探测器前方有一个针孔(pinhole) ，几何尺寸可调。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测针孔范围之内，而其它来自焦平面上方或下方的散射光，都被挡在探测针孔之外而不能成象。光束扫描器又分为单光束、多光束或狭缝扫描器几种。其中单光束扫描获得的图像质量最好，狭缝扫描器虽然产生图像的速率很高(可达实时水平) ，但其图像信噪比低于单光束扫描，这是因为从狭缝长轴来的漫射光不能被有效遮挡。多光束扫描如碟片式共聚焦是由电动马达驱动Nipkow 盘旋转而实现的，其荧光量较低，速率一般较高。 宽场反卷积技术与共聚焦技术比较表 二、API 高分辨活细胞成像系统的主要特点 DeltaVision 活细胞成像系统有以下优势： 1）高灵敏：得益于精密和高效的光路，以及领先的还原型反卷积技术，DeltaVision 将宽场显微镜的灵敏度和分辨率提高到新的水平，标准配置下最低可以探测到13个GFP 分子，成为目前为止最灵敏的光学显微系统之一。 HIV 病毒通过DC 细胞和T 细胞的接触侵染T 细胞，绿色颗粒为HIV 病毒 2）高速：标配下可达到 21 帧/秒（512×512）的成像速度。当配备EM-CCD 后，最高可达到224 帧/秒（64×64），可用于囊泡运动和钙火花等快速的生理生化过程观察。 3）低光毒性：得益于灵敏度的显著提高，即使微弱的荧光，也可以收集到足够的信号，因此激发光的强度和时间可以大幅度减少。光损伤和光淬灭不再是活细胞和微弱荧光观察的障碍。 4）智能：焦点漂移和细胞脱离视野是活细胞观察的梦魇。DeltaVision 特有的自动对焦（autofocus）和细胞跟踪（cell tracking）功能，不仅可以自动维持焦平面的稳定，而且能够跟踪移动的细胞，使这些问题迎刃而解，长时间连续的活细胞观察不再困难。 通过对荧光信号和细胞轮廓的识别，DeltaVision 可以精确的跟踪需要观察的细胞。 5）免维护：整个系统无易损易耗部件，光源寿命在 5000 小时以上，可正常使用7-10年以上，无需更换光源和校准光路。。系统控制和图形处理基于Linux 操作系统，更适合多线程控制和数据处理，不仅大幅度降低了数据处理时间，也避免了在数据传输过程中感染病毒的危险。人性化的softWoRX软件简单易用，一个对话框内即可完成所有的控制操作。 三、API 高分辨活细胞成像系统的主要功能与应用领域 1）多维成像 目前可以做到六维（XYZ 三维，时间，不同点，不同波长）成像。通过光学切片（optical section）技术，实现对样品的3D 观察，构建样品的立体结构。 经过3D 重建的肿瘤细胞：A 为正面，B 为旋转30 度后，C 为旋转90 度后。 2）3D 还原型反卷积处理 显微镜的分辨率和图像的对比度取决于物镜收集的光学信息。显微镜光路中衍射和折射现象的存在，使得样品信号的位置和强度都发生了变化，降低了系统的分辨率和图像的质量。API 作为对图像数据进行反卷积处理最早的实践者，将显微镜的硬件设计和后期软件处理完美的结合在一起，通过对光学信号的3D 还原型反卷积处理，大大提高了显微镜的灵敏度和分辨率。 原始图像和经过3D 反卷积处理后图像的对比：A，B 为处理前，C，D 为处理后。 经过反卷积处理后，信号的强度和图像对比度得到很大提升。 3）延时摄影 通过软件精确的控制，拍摄的时间间隔从数秒到数小时不等，在长时间拍摄下也不会造成荧光信号的淬灭。根据实验需求的不同，无论单一层面还是3 维结构，都可以获得良好的效果。 正在分裂的Hela 细胞，其中绿色标记微管蛋白，红色标记染色体 4）高速离子成像 结合高速 CCD 和高效的光路，在512×512 像素下仍然可以实现21 帧/秒的成像速度。对于快速的离子浓度的变化，最快可以50-100 帧/秒的速度获取图像。 细胞间钙信号的传递。使用Fluo‐3 标记胞内的钙离子，并给予荧光信号对钙离子的强度进 5．荧光共定位分析 通过比较多个荧光通道的定位情况，即可知道他们在空间上和时间上的分布信息，进而得到相应的荧光信号是否存在相互作用、协同运动、定向运输等。 体外重组的病毒颗粒侵染细胞，绿色标记病毒的壳蛋白，红色标记病毒的RNA结合蛋白。病毒入侵前，由于病毒颗粒完整，绿色信号和红色信号共定位。病毒入侵细胞后，脱掉表面的壳蛋白，绿色信号和红色信号分离。 6）荧光共振能量转移（FRET） DeltaVision 特制的活细胞滤片组保证CFP/YFP，GFP/mcherry（RFP）荧光强度的精确记录，并进一步计算出蛋白对之间精确的能量转移系数。 计算不同荧光通道荧光信号的强度，进一步可得到能量转移系数。 主要应用领域： 1）细胞迁移与细胞骨架； 2）细胞分裂与细胞周期； 3）细胞信号转导； 4）组织分化与发育； 5）囊泡和蛋白运输； 6）生理学和神经科学； 7）钙离子信号研究； 8）蛋白质与DNA 的相互作用； 9）宿主与病原体相互作用； 10）癌症研究； 11）药理研究； 12）生物物理研究。 |
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