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2006-01-26 18:58
我是用组织提取RNA的,总体来讲,提RNA就怕降解,我是在夏天空调间做的,开始的时候有一批都不是很好,但是总的来讲,组织里的RNA量应该足够的。你提RNA的容器一定要灭RNA酶,我们的办法是包括离心管枪头等都用DEPC水浸泡至少半天,有的文献是1hs就可,然后放在也浸泡过的饭盒(铝质)中高压灭菌,做的时候要戴口罩,手套和帽子,因为有RNA酶的问题,我用匀浆器的处理组织,处理时同时加入1ml trizol,组织不要太大,像上面提的只要半粒绿豆大小约40mg就可(组织取材没有特别要求,我是取下后立即用生理盐水或PBS洗2遍,然后放入已DEPC处理的冻存管中直接浸入液氮,用时直接取出就可),整个过程都在冰上进行,以减少降解。下面是我提RNA的步骤。
RNA的抽提:(1~6步骤放在冰上)总RNA最后保存在-80 oC中 1.从组织标本置于匀浆器中,同时加入1mlTrizol匀浆并充分溶解。 2.加入200ul氯仿,猛烈颠倒20次,充分混匀。放置5分钟。 3.4oC、12000g离心15min。 4.转移上清至1.5mlEP管中,加入异丙醇500ul混匀(上下颠倒几次,放置10分钟),沉淀2-3分钟后,4oC、12000g离心15min。 5.弃去上清,加入600ul75%乙醇混匀;4oC、12000g离心5min~10min)。 6.弃去上清,加无水乙醇800ul,混匀;4oC、12000g离心5min~10min)。 7.弃去上清,干燥。加DEPC水溶解,定量并将RNA浓度调至0.5ug/ul。 这样的RNA用DNA/RNA测定仪测定混合物的浓度和纯度,测定OD260/OD280值能在1.8~2.2之间,我的结果大部分在1.9左右。 以上心得仅供参考。 |
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2006-01-29 01:41
磨的过程中要注意手套不要到处摸,最好一个就换个手套。
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2006-01-25 05:03
1。从细胞中提取RNA是不需要匀浆或是研磨的,其实离开本来生存的环境,不论是细胞还是组织都有可能降解RNA,所以其实要缩短研磨或是匀浆的时间,所以细胞是没有必要研磨的,组织研磨是因为单单靠TRIZOL来裂解他是没有办法是RNA完全释放的,因为组织不像细胞只是一层细胞壁而已有很多其他的物质影响RNA的释放
2。我一般使用匀浆器,因为液氮操作起来比较危险,而且液氮要不断加入比较浪费时间,其实匀浆的关键是彻底才能避免杂质污染,最好匀浆后离心一次去除沉淀,恐怕和DEPC处理有关,大凡作RNA的人其实操作都很小心,最关键的就是样本质量以及DEPC处理的问题,只要注意这两点一般是可以得到很好结果的 |