【讨论】胰腺组织石蜡切片免疫荧光...

【讨论】胰腺组织石蜡切片免疫荧光

展开引用

gaoying115

我上次的图，小鼠胰腺，鼠源insulin一抗。
楼上您好，我初做这方面的实验。您是该领域的高手，能麻烦参考您的protocol一看吗？
您做的是石蜡还是冰冻切片？都说用冰冻好，我感觉反而石蜡组织结构要好些。
我做小鼠胰腺，考虑鼠源的一抗可能与组织有交叉反应，换了个羊源insulin一抗，也是santa的，结果背景好了些，没有周围胞膜网格样染色了，但胰岛染色很弱，santa一抗1:200稀释的，因组化是这个浓度，荧光的话，抗体浓度是不是要加大？我准备1:50或1:100试试。二抗invitrogen的1:1000稀释是否合适，我周围的人都用这个浓度。还有PBS洗的问题，我用浸在染缸洗的方式脱片严重，后改为滴在上面洗，不知是否合适？
恳请大侠指教，说是简单的实验，可我做了几次都不理想，实在不知怎么办了。因后面要双标，胰岛素染不好，后面怎么染？
望大侠能分享下您的protocol还有经验心得，在此跪谢！

......

这个片子首先看起来清晰度不够高，焦距是否没有调好，可以调整放大看一下，其次背景有点高，非特异性染色较强
上面发的图是石蜡切片的三标染色，个人没有感觉冰切优于石蜡切片，做的好石蜡图像会更漂亮
santa的goat来源insulin抗体 sc-7839 效果很不错，对于荧光染色1:500足矣，抗体浓度过高易导致高背景
二抗invitrogen or jackson 都是1:1000稀释即可
关于脱片问题，首先载玻片要防脱，石蜡切片实验前要适当烤片，洗片首选浸洗
这个实验要注意几点：组织防脱、抗原修复、充分封闭、抗体孵育合理、洗片充分。
protocol见附件

Immunohistochemistry.docx(13.32k)

展开引用

gaoying115
非常感谢qq69305632战友的回复！
1. 可能我做的冰冻切片不好吧，换了个石蜡切片，背景就没有周围胞膜网格样染色了，我是4%多聚甲醛固定了40min，后蔗糖脱水过夜，OCT包埋，速冻后切片的，应该与我切片有关吧。
我们那荧光显微镜高倍不清晰，就没拍40倍的。
2. 我一抗二抗孵育后都洗了5min*5次，不知是否洗的时间长了而导致脱片？
3. 另外，我看到了您的protocol，封闭、洗涤等都是用的TBST，我用的是PBS，请问，这个有影响吗？T是tween吗，浓度是0.5%吗？
4. 还有石蜡切片抗原修复很关键，时间有要求吗？我们那都是加枸橼酸修复液，沸腾后1min30s，这时间可以吗？
问题有些多，再次感谢您的热心帮助！

......

1、组织固定时间与你的胰腺大小有关，不能一概而论，全胰腺固定的话40min有点少，可以延长到2-3hrs充分固定，染色有差异应该与你的制片有一定的关系
2、你的洗片时间不算长，没有剧烈的晃动话，组织脱片还是和你防脱没有做好有关
3、这个会有一定影响，TBST是TBS-0.1%tween，tween-20是一种去垢剂，可以去除背景杂质，PBS-0.1%tween亦可
4、抗原修复很关键！针对insulin抗原修复，我的经验是枸橼酸钠微波加热到90-95℃，不要让其沸腾！放入切片保持该温度5-10min取出冷却即可进行后续实验

还有请教下如何可以染成这种图片，

这是免疫荧光双标法吗？如何操作，下面是百度的~

过程和一般的免疫染色一样就是封闭的时候用两种血清混合封闭1：1

加入一抗和二抗的时候也是混合加入

但是因为稀释浓度不好掌握最好提前作预试~

补充一点，荧光双标记必须选择的一抗抗性不同，如一个是兔多抗，一个是鼠单抗，那么二抗分别采用抗兔，抗鼠的不同颜色标记的荧光二抗即可。

刚刚传的照片没显示，现在在发一遍
这个是红光标记的胰岛素


这个是绿光标记的胰高血糖素


这个DAPI染的核


这个是合成的照片


很漂亮吧 ··

这样的二抗选择应该是可以做出来的，
但是绿光的荧光二抗一般都是很浅的，这个绿光的稀释比是1:50做的，
jackson是国外抗体，网址我发你啊http://www.jacksonimmuno.com/pdf/specs.asp
组化做不出是不是抗体不行呀，现在santa的抗体都水了，我们实验室现在都用EPI的抗体 效价高呀，
现在二抗好点的公司就是jackson和KPL了吧··
组化也要用双氧水处理，切片放入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。

我怎么做成这样啊，1:50，孵育二抗一个半小时
[img]file:///C:/Documents%20and%20Settings/Administrator/Application%20Data/Tencent/Users/452425168/QQ/WinTemp/RichOle/1QA`L1O34M@R8PQS94SKJ$I.jpg[/img]

帖子已被删除

上传图片看一看 胰岛的染色相比较还是比较简单的
以下是本实验室的胰岛染色结果

我上次的图，小鼠胰腺，鼠源insulin一抗。
楼上您好，我初做这方面的实验。您是该领域的高手，能麻烦参考您的protocol一看吗？
您做的是石蜡还是冰冻切片？都说用冰冻好，我感觉反而石蜡组织结构要好些。
我做小鼠胰腺，考虑鼠源的一抗可能与组织有交叉反应，换了个羊源insulin一抗，也是santa的，结果背景好了些，没有周围胞膜网格样染色了，但胰岛染色很弱，santa一抗1:200稀释的，因组化是这个浓度，荧光的话，抗体浓度是不是要加大？我准备1:50或1:100试试。二抗invitrogen的1:1000稀释是否合适，我周围的人都用这个浓度。还有PBS洗的问题，我用浸在染缸洗的方式脱片严重，后改为滴在上面洗，不知是否合适？
恳请大侠指教，说是简单的实验，可我做了几次都不理想，实在不知怎么办了。因后面要双标，胰岛素染不好，后面怎么染？
望大侠能分享下您的protocol还有经验心得，在此跪谢！

展开引用

gaoying115

我上次的图，小鼠胰腺，鼠源insulin一抗。
楼上您好，我初做这方面的实验。您是该领域的高手，能麻烦参考您的protocol一看吗？
您做的是石蜡还是冰冻切片？都说用冰冻好，我感觉反而石蜡组织结构要好些。
我做小鼠胰腺，考虑鼠源的一抗可能与组织有交叉反应，换了个羊源insulin一抗，也是santa的，结果背景好了些，没有周围胞膜网格样染色了，但胰岛染色很弱，santa一抗1:200稀释的，因组化是这个浓度，荧光的话，抗体浓度是不是要加大？我准备1:50或1:100试试。二抗invitrogen的1:1000稀释是否合适，我周围的人都用这个浓度。还有PBS洗的问题，我用浸在染缸洗的方式脱片严重，后改为滴在上面洗，不知是否合适？
恳请大侠指教，说是简单的实验，可我做了几次都不理想，实在不知怎么办了。因后面要双标，胰岛素染不好，后面怎么染？
望大侠能分享下您的protocol还有经验心得，在此跪谢！

......

这个片子首先看起来清晰度不够高，焦距是否没有调好，可以调整放大看一下，其次背景有点高，非特异性染色较强
上面发的图是石蜡切片的三标染色，个人没有感觉冰切优于石蜡切片，做的好石蜡图像会更漂亮
santa的goat来源insulin抗体 sc-7839 效果很不错，对于荧光染色1:500足矣，抗体浓度过高易导致高背景
二抗invitrogen or jackson 都是1:1000稀释即可
关于脱片问题，首先载玻片要防脱，石蜡切片实验前要适当烤片，洗片首选浸洗
这个实验要注意几点：组织防脱、抗原修复、充分封闭、抗体孵育合理、洗片充分。
protocol见附件

Immunohistochemistry.docx(13.32k)

非常感谢qq69305632战友的回复！
1. 可能我做的冰冻切片不好吧，换了个石蜡切片，背景就没有周围胞膜网格样染色了，我是4%多聚甲醛固定了40min，后蔗糖脱水过夜，OCT包埋，速冻后切片的，应该与我切片有关吧。
我们那荧光显微镜高倍不清晰，就没拍40倍的。
2. 我一抗二抗孵育后都洗了5min*5次，不知是否洗的时间长了而导致脱片？
3. 另外，我看到了您的protocol，封闭、洗涤等都是用的TBST，我用的是PBS，请问，这个有影响吗？T是tween吗，浓度是0.5%吗？
4. 还有石蜡切片抗原修复很关键，时间有要求吗？我们那都是加枸橼酸修复液，沸腾后1min30s，这时间可以吗？
问题有些多，再次感谢您的热心帮助！