【专题讨论】蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持，尽管问：...

【专题讨论】蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持，尽管问：）[精华]

老师请教你几个问题：
1.菌体上清过Q柱，收集穿过（未超过载量），分段洗脱（10%-45%含有目的蛋白），将含有目的蛋白段上苯基柱，收集洗脱，在上清、穿过、分段洗脱（10%-45%）、洗脱在同一浓度做ELISA检测，结果显示穿过的值较后两个都高，是什么原因，为什么Q会挂得不好。
2.最近在做一蛋白，20mM磷酸盐缓冲液，PH7.4，过Q柱，线性洗脱显示，前50%含有目的蛋白，在上苯基柱（20mM PB+0.5M NaCl/20mM PB，PH7.4），穿过无目的蛋白，用20mM PB洗脱时能洗下很少一点，用水洗脱时目的蛋白基本洗下，但是都很不纯（我目的蛋白20KD,在40KD处有个很明显的条带），请问老师这种应该怎么做，（凝胶柱G75分不开），怎么进行后续试验，谢谢了！

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cszopen
版主你好：我最近一直在做纯化，但结果一直不好，请你帮忙分析一下。我用的表达载体是pET32a，转化BL21(DE3)进行表达。蛋白等电点8.938，是一个细菌的外膜蛋白。
包涵体纯化：变性结合缓冲液、漂洗缓冲液、洗脱缓冲液pH值分别为：8.0、6.3、5.9.。（这是按柱子的说明书做的）用的是Ni-NTA柱。本来想纯化复性一起做，但蛋白挂不上柱，基本都在穿过峰中流下来了。后来才先做纯化。
但纯化的结果是，目的条带在穿过峰中很少（应该说明挂柱情况还可以吧？），大部分蛋白在漂洗缓冲液中就洗下来了，而洗脱缓冲液中的量很少（感觉这很不正常，不知为何？应该在洗脱液中量多一些才对吧？）。（附图2张）前面一张marker左边有条带的部分为漂洗液中漂洗下来的目的蛋白，再前面是穿过峰。后面一张最左边的几条带为洗脱缓冲液洗脱下来的目的带，但量却很少。不知道为什么会出现这种情况？
还有一个问题，蛋白的等电点对蛋白的纯化有没有影响，多大影响？缓冲液的pH值跟它应该没有关系吧？那在透析复性是透析液的pH值是否受等电点的影响？看资料说，透析时透析液的pH值一般在8.0-9.0之间比较合适。那就跟我的蛋白等电点很近了，不知有没有影响？

辛苦版主解答一下，初次做纯化，说的可能比较啰嗦。:)

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那说明书是有点误导，其实说明书只参考，但是大多人把它当金科玉律，对大多包涵体，用降低pH是洗不下蛋白的,即使少数可以也可能杂蛋白洗不干净,你可选择用不同浓度的咪唑洗试试.何况从你第一张电泳图看,穿透的很干净,那你就收集穿透的不就得了,纯化不一定洗脱的才是你要的:)通常缓冲液都不应该和等电点太近,否则容易沉淀.纯化通常要灵活,书或别人的经验只是参考.

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scfsl
老师请教你几个问题：
1.菌体上清过Q柱，收集穿过（未超过载量），分段洗脱（10%-45%含有目的蛋白），将含有目的蛋白段上苯基柱，收集洗脱，在上清、穿过、分段洗脱（10%-45%）、洗脱在同一浓度做ELISA检测，结果显示穿过的值较后两个都高，是什么原因，为什么Q会挂得不好。
2.最近在做一蛋白，20mM磷酸盐缓冲液，PH7.4，过Q柱，线性洗脱显示，前50%含有目的蛋白，在上苯基柱（20mM PB+0.5M NaCl/20mM PB，PH7.4），穿过无目的蛋白，用20mM PB洗脱时能洗下很少一点，用水洗脱时目的蛋白基本洗下，但是都很不纯（我目的蛋白20KD,在40KD处有个很明显的条带），请问老师这种应该怎么做，（凝胶柱G75分不开），怎么进行后续试验，谢谢了！

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挂不好也许和缓冲液及pH有关.不纯很正常,也许吸附比较牢,你可选择丁基或别的方法.

请教您一个问题：我提的动物组织蛋白，再利用TCA-丙酮除盐后的沉淀蛋白不能溶解，这是为什么？（TCA沉淀的蛋白利用丙酮反复洗两到三遍仍不能溶解）

请教您一个问题：我除热原使用阴离子填料Q Sepharose FF，缓冲体系20mM PB,pH6.0,为何过柱之后pH值会变化，降至4.0，就算预平衡10个柱体积，pH值依然是4.0左右。是否说名磷酸盐缓冲液不适用于离子交换填料，那么pH6-7之间还有什么合适的缓冲体系可以选择？多谢楼主啦

quguoli83
请教您一个问题：我提的动物组织蛋白，再利用TCA-丙酮除盐后的沉淀蛋白不能溶解，这是为什么？（TCA沉淀的蛋白利用丙酮反复洗两到三遍仍不能溶解）

TCA-丙酮沉淀蛋白的变性是不可逆的,通常难溶解,除非是变性条件下,如加电泳缓冲液煮,而普通缓冲液不能溶解很正常.

caron_zk
请教您一个问题：我除热原使用阴离子填料Q Sepharose FF，缓冲体系20mM PB,pH6.0,为何过柱之后pH值会变化，降至4.0，就算预平衡10个柱体积，pH值依然是4.0左右。是否说名磷酸盐缓冲液不适用于离子交换填料，那么pH6-7之间还有什么合适的缓冲体系可以选择？多谢楼主啦

通常阳柱选择磷酸盐缓冲液,而阴柱选择tris-Hcl缓冲液,不过我觉得应该是你没平衡到,多平衡时间看看,

楼主你好，请问一个离子交换层析的问题，我使用的是GE 的 Q SFF 填料，XK-16,XK-26都使用过，目前采用此柱进行内毒素的去除，之前此柱也有过类似操作，使用1N NaOH 处理层析柱1h，问题如下：上样蛋白分子量约为200KDa，有不确定含量的糖基化，通过预装柱及XK-16条件摸索，确定pH7-8的范围，5ms/cm，可以与填料较好结合，进行分离，预实验时上样量约为20mg，正式实验时，CV=65ml，上样量超过200mg，突然出现流穿，且流穿蛋白浓度上升很快，可接近上样浓度，请问有什么可能的原因么？为排除填料载量问题，使用过其他较新层析柱，出现同样问题，且在上样过程中检测到pH值会下降0.3左右，再平衡后才恢复正常。

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zzzzz2001
楼主你好，请问一个离子交换层析的问题，我使用的是GE 的 Q SFF 填料，XK-16,XK-26都使用过，目前采用此柱进行内毒素的去除，之前此柱也有过类似操作，使用1N NaOH 处理层析柱1h，问题如下：上样蛋白分子量约为200KDa，有不确定含量的糖基化，通过预装柱及XK-16条件摸索，确定pH7-8的范围，5ms/cm，可以与填料较好结合，进行分离，预实验时上样量约为20mg，正式实验时，CV=65ml，上样量超过200mg，突然出现流穿，且流穿蛋白浓度上升很快，可接近上样浓度，请问有什么可能的原因么？为排除填料载量问题，使用过其他较新层析柱，出现同样问题，且在上样过程中检测到pH值会下降0.3左右，再平衡后才恢复正常。

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很难说是什么原因,我觉得也许你样品的缓冲液和平衡柱子的不一致或样品有盐或缓冲液浓度过高,你可就这几方面改变看看,此外可稍微提高结合的pH也许会好点,流穿到开始的浓度那说明填料已经饱和了,此外你可稍微降低流速看看,总之自己做些改变,找到相应的原因和解决方法.

楼主，最近我要进行Purifier的校正，但是说明书丢了电导率仪校正不好 求标准方法 谢谢