【专题讨论】蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持，尽管问：...

【专题讨论】蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持，尽管问：）[精华]

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新手请教前辈：
1。超声破碎会把大肠杆菌诱导表达的目的蛋白质片段打碎从而影响其活性吗？我在大肠杆菌中诱导的是蛋白磷酸酶，一种融合蛋白，要保持其活性，请问用哪一种常规破碎方法比较好？
2。Ni-NTA过柱需要那些填料？麻烦高手您给说细致些，谢谢。
3。本人在做一种蛋白磷酸酶,所买试剂盒的缓冲液呈碱性,是8.4,与我酶的等电点（7.2）不符合, ,问要在这种情况下操作使该酶不失活,并且得率可以，该如何操作或者是改变什么条件?谢谢了.
4。过普通大小的镍或钴凝胶层析柱，需要摇多少菌就可以？
5。镍柱和钴柱都可以进行组氨酸标签蛋白质的纯化，在纯化一个组氨酸标签的融合蛋白（酶）两者可以互换吗，前者换为后者是否影响活性？如果不能，有什么条件限制？

......

1.控制好温度，超声破碎应该没问题．２．需要镍NTA琼脂糖凝胶或别的Ni-NTA填料及柱子或直接买预装柱,详细使用见www.wsac.cn 资料下载下的镍NTA琼脂糖凝胶FF说明书.3.最好查资料,如果不清楚可先用试试.4.最好别选钴的,作用力太弱.要多少不清楚,因为和你表达量有关,一毫升填料可上5-10mg目标蛋白,所以可自己计算.5,没问题.

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海上的1900
chromatography战友，
我打算用HPLC分离已经初步纯化的蛋白，大小40kd到200kd，机器是安捷伦1200.
目前只有C18的柱子，用来分环肽。
如果分比较大的蛋白，有什么效果相对好的柱子，请推荐一下。

在网上见到有人说C18也可以试着分析大蛋白，不知道会不会堵，洗不下来？

......

应该可以,只要你填料孔径是300埃的适合蛋白分析的就可以,最好问公司技术人员.

chromatography兄您好：
今天做了个实验出现个现象我不太明白，麻烦你帮我分析一下：
一个蛋白用ni-柱亲和层析纯化，平衡缓冲液位20mMpb，ph8.0，0.5m NACL,1mM DTT,可是刚开始平衡时ni柱就变成棕色的了，怀疑是DTT的原因，以前做过此实验，没有加DTT,没有出现过类似现象，DTT对ni柱有什么影响啊？

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xingtingting
chromatography兄您好：
今天做了个实验出现个现象我不太明白，麻烦你帮我分析一下：
一个蛋白用ni-柱亲和层析纯化，平衡缓冲液位20mMpb，ph8.0，0.5m NACL,1mM DTT,可是刚开始平衡时ni柱就变成棕色的了，怀疑是DTT的原因，以前做过此实验，没有加DTT,没有出现过类似现象，DTT对ni柱有什么影响啊？

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对,被还原了,可改用ni-NTA填料或别加DTT.

chromatography 老师：
您好，我有几个问题想请教您，就是我看到GE公司resource S和Q预装柱的说明书，有“阴离子柱应避免使用阴离子型去垢剂，阳离子柱应避免使用阳离子型去垢剂”，不知道如果使用了会对柱子有什么损害？还有就是我现在在纯化一种蛋白，但是要用到一种“兼性去垢剂”，不知道能不能带着它上resource S和Q柱呢？
谢谢！

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zxdlilon
chromatography 老师：
您好，我有几个问题想请教您，就是我看到GE公司resource S和Q预装柱的说明书，有“阴离子柱应避免使用阴离子型去垢剂，阳离子柱应避免使用阳离子型去垢剂”，不知道如果使用了会对柱子有什么损害？还有就是我现在在纯化一种蛋白，但是要用到一种“兼性去垢剂”，不知道能不能带着它上resource S和Q柱呢？
谢谢！

......

我觉得你可试试,通常去垢剂对离子柱子没什么损害,要不你可问他们的工程师.

chromatography兄您好：
我想问您一下羟基磷灰石这种介质应该如何溶胀啊 ？

xingtingting
chromatography兄您好：
我想问您一下羟基磷灰石这种介质应该如何溶胀啊 ？

这填料有好几钟,不同厂家不一样,你最好是看说明书,干粉的通常直接泡过夜,如果是液体保存的就不需要溶胀,装柱用即可.

请问楼主，我要用COIP的方法纯化细胞系中的蛋白质，所用抗体的量和浓度是多少？多谢！

wujinzi
请问楼主，我要用COIP的方法纯化细胞系中的蛋白质，所用抗体的量和浓度是多少？多谢！

你最好是查文献或实验书,我没做过.