RIPA提蛋白后总有透明粘稠的胶冻样物质，求解决办法...

欧易生物发布全自动定量Western检测服务，告别繁琐的实验步骤，从此Western检测只需3小时即可得到25个样本的定量分析数据，全程仪器自动化操作！更多详情请点击：http://www.oebiotech.com/Projects/western_blot.html

展开引用

xiaoer25

claire萱

RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？

楼上的问题我们在提取过程中也遇到过，解决方案有两个：一、增加裂解液RIPA的量，用枪头吸打混匀。一般出现胶状的话，枪头吸打混匀时就会发现是否有胶状。来增加或减少RIPA的量。（我们实验发现如出现胶状，蛋白浓度反而低）二、采用超声破碎一下。一般都能解决这个问题，我们采用方法一为多。友情提示下，PMSF最好是在用使用之前用加入，PMSF容易水解，大概遇水30min就会失效，所以最好不要提前很长时间加入 PMSF.

......

请问一下如果PMSF容易水解的话，那么为什么加入PMSF的Lysis Buffer放置-20度冰箱数周后，拿出来溶解还是可以闻到PMSF的味道呢？前提是Lysis Buffer已经用过几次，反复冻融，还是可以闻到PMSF的味道

欧易生物发布全自动定量Western检测服务，告别繁琐的实验步骤，从此Western检测只需3小时即可得到25个样本的定量分析数据，全程仪器自动化操作！更多详情请点击：http://www.oebiotech.com/Projects/western_blot.html

展开引用

claire萱

RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？

......

展开引用

合肥周三

claire萱

RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？

多煮一会

......

我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？

展开引用

claire萱

合肥周三

claire萱

RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？

多煮一会

我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？

......

可以使用那种小注射器带针头的，反复抽打样品

去垢剂加少了

展开引用

合肥周三

claire萱

合肥周三

claire萱

RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？

多煮一会

我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？

煮过不测，

......

煮过不测浓度怎么保证上样量一致呢？求解答