【讨论】再谈免疫组织化学Triton X-100破膜和二抗封...

【讨论】再谈免疫组织化学Triton X-100破膜和二抗封闭原理问题

对于上述问题讨论的焦点，本人通过自己的实例来阐述其中必然存在的重要问题。
首先打孔其实是没那么神话的东西，因为其实往往影响免疫学染色结果的（包括IHC,IHC-F,IF）重要因素是你的抗原固定的选择和固定的程度。对于常规使用的10%福尔马林和4%PFA（多聚甲醛）来说，有一个必然的结果就是当你觉得固定的越充分的时候，就越难出结果。原因，在于尽管PFA不像10%福尔马林那样会对抗原形成很强的封闭作用（封闭的原因在于甲醛能和抗原形成结合键，从而封闭抗原，这也是为什么石蜡切片为什么往往需要抗原修复的原因），但是这种现象也时常发生。举例，我第一次用4%PFA固定的小鼠肿瘤标本是在室温下，而且只固定了12小时作用（4℃），但是几乎在不打孔的情况下，我可以很轻松的做出很多抗体（不打孔，不修复，而且抗体用的极少1:200，说明书建议为1:50），而且结果还可以，尽管有少数看着不是非常特异。而在第二批标本中，为了我以为的能延长标本在-80℃的保存时间，我“改进”了固定的时间（室温，固定18小时），结果同样的条件，同样的抗体，到1:50的时候才勉强能做出来（抗体是CD31），这正好说明了上述问题，固定越充分那么抗体就会越难做。在给予0.2% Triton-X100 打孔后，结果略微有所改善，者说明打孔并不是一个能充分解决这个问题的方法。同样的道理，在抗原暴露不充分的情况下，有些不像CD31这样有明确形状式定位的抗体的结果是否特异是很难判断的，所以很多时候的免疫荧光结果是有问题的，只是我们并没有去深究罢了，就像文献里往往能做出超级漂亮的结果，而我们的定位总是隐隐约约和他们的有些许的不一样，原因可能就在于此。所以这里我再次声明，Triton-X100对结果的影响是甚微的，也许它能增强结果，但是反应的不一定是最真实的抗原定位结果。所以我建议，大家可以尝试 抗原修复，对于冰冻切片，4%PFA固定的片子，可以选择比石蜡抗原修复缩短30%时间的方法来进行，并且这样会很省抗体，道理很简单，都是检测抗原位点，凭什么IF的抗体稀释比总是比IHC高出这么多，原因可能就在于此。希望大家能做出漂亮的结果。

这个帖子很好。
第一个问题，wan版说得很好。
1.理论上来说：
1）对于核蛋白，是必须打孔的。
2）对于抗原和抗体结合位点在细胞膜的蛋白，不打孔也是可以的。打孔对结果也没有影响，只是多此一举。
3）对于跨膜蛋白，抗原和抗体结合位点在胞内的，需要打孔；在胞外的，不需打孔。
2.在实际操作中，在细胞样本的制作中，可能出现细胞破损，这样，在不打孔的情况下，核蛋白及在结合位点在胞内的蛋白也可能着色。
3.如果不知道某个蛋白是属于什么情况，要查文献。实在不知道，就打孔吧，因为不影响实验结果。
第二个问题，除了技术支持所说的，还有一个因素。
假设一抗是从动物一中得来的，二抗是从动物二中得来的。在二抗的制备过程中，不可避免含有动物二的自身抗体。而这些自身抗体可能与样本的非特异抗原结合形成非特异着色。
如果在二抗孵育前，先用来自二抗来源的血清封闭，二抗来源的血清含有动物二的自身抗体。
那么，这些自身抗体就会与样本的非特异抗原先结合。再加二抗后，则会大大减少二抗中自身抗体与样本的非特异抗原结合的机会。
BSA成分单一，也不含有动物二的自身抗体，封闭效果就不如二抗来源的血清。
第三个问题，影响因素较多。
1.不同细胞的固定方法，对实验结果确有影响。建议用4%多聚甲醛。
2.对于确定只在细胞膜结合的蛋白，可以不用triton X-100 破膜。缩短孵育时间，减少抗体浓度，增加清洗时间等等，都可以减少非特异着色。
3.如果经过反复调整实验流程，仍有非特异着色，考虑是抗体问题。

谈一点个人了解，供您参考:
1破膜是非必需步骤，所以理解不必把它当常规。
2封闭主要是封闭蛋白与蛋白间的非特异性结合，所以多数情况下可用BSA。
3会不会是抗体质量问题？

请看来自Life Technologies技术支持的解答，供大家参考。
life的技术支持，此次解答是赵静老师回答的，一并表示感谢。
首先关于第一个问题，您的理解是非常正确的。
第二个关于封闭的问题，因为血清中含有多种的蛋白或者IgG，在加一抗、二抗之前与样本先孵育，可以借用血清中的蛋白或者免疫球蛋白IgG等，将样本中能够与蛋白或者IgG等结合的位点先占据，这样在加一样、二抗的时候，一抗和二抗就更多是去识别特异的位点，而不会与样本的其他无关位置有非特异性结合。
选择与二抗来源一致的血清封闭，是为了避免二抗与封闭的血清中的成分再次发生非特异性结合。至于BSA也是类似的原理，不过因为其中的成分单一，所以相对来说封闭的效果是不如血清的。
关于第三个问题，这种情况大多是因为细胞固定的方法引起的，请问您是采用的哪一种的固定方法，针对您的这种抗体，您可以考虑改变固定方法，如用多聚甲醛，冰丙酮，甲醇或者甲醇与丙酮不同配比等，您可以上网百度一下“不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响”，应该可以搜索到不同固定方法的建议，调整一下会有改善的。
希望以上信息有所帮助，如有其它技术问题，欢迎继续联系我们。

步行中
谈一点个人了解，供您参考:
1破膜是非必需步骤，所以理解不必把它当常规。
2封闭主要是封闭蛋白与蛋白间的非特异性结合，所以多数情况下可用BSA。
3会不会是抗体质量问题？

关于第1和第2个问题，请看life的解答，供你参考。
第3个问题，也有可能是抗体质量的问题，但是我估计换抗体是不可能了。我决定试试其他的固定方法。
感谢参与讨论！

以下是sigma的技术支持的回复，供大家参考：
此次解答的是许颖老师，一并感谢。
1.Triton X-100：您对于Triton的作用理解是准确的，其目的就是在细胞膜上打孔，以让抗体能够顺利进入胞内或核内。对于抗原表位暴露在细胞膜外的膜蛋白，是可以直接检测，不需Triton处理，但是由于蛋白是在胞内合成，Triton处理后，也可检测到胞浆中尚未转移到膜上的蛋白。同时，考虑到后续的染核等操作，Triton通透处理还是需要的。
2. 封闭液：封闭的作用在于将片子中没有结合细胞或者蛋白的空白部位也结合上蛋白，因为在细胞爬片的过程中，不会完全覆盖片子，即时细胞数很多，也有可能会有间隙，空白部位会非特异地结合一抗，从而增加背景染色，不是因为样品与二抗之间有特异反应，基于此，用不与一抗和二抗反应的蛋白即可达到封闭目的，所以用二抗来源的血清或者BSA都可以用于封闭。
3. 在IF实验流程与操作没有问题的情况下，更换新的样本或细胞，反复出现非特异性染色，建议更换其它来源或货号的抗体，看是否正常；因为细胞是三维结构，而IF看到的是二维，有可能目的蛋白正好处于核的正面或背面，看着像在核内；另外该蛋白虽然是胞浆蛋白，是否结合在核膜上；如果以上都不是，那么建议更换抗体试试。

感谢上述分享，又让我长见识了。我之前没有破膜的细胞，对染核没有什么影响的，个人认为检测膜蛋白不破膜是可行的

以下是amyjet的技术支持的回复，供大家参考：
具体如下：
1.我建议您可以不用打孔，直接做免疫荧光，可以用比常规低的浓度，短时间打孔。因为实验本身是要不断摸条件的，您可以采取不同方法，找到最好的条件
2.样品中含有一些能够和一抗或者二抗结合的非特异性位点，比如Fc受体，这时候加入蛋白封闭住这些位点就会减少非特异性结合。用bsa如果用二抗来源的血清更好。bsa在IF的作用和它在wb中的作用类似，起一个封闭的作用
3.这可能是抗体浓度高，封闭时间短，一抗孵育时间长导致的非特异性结合。建议您吧一抗调到最高稀释比例，4度封闭过夜，一抗常温1h

这个帖子很好。
第一个问题，wan版说得很好。
1.理论上来说：
1）对于核蛋白，是必须打孔的。
2）对于抗原和抗体结合位点在细胞膜的蛋白，不打孔也是可以的。打孔对结果也没有影响，只是多此一举。
3）对于跨膜蛋白，抗原和抗体结合位点在胞内的，需要打孔；在胞外的，不需打孔。
2.在实际操作中，在细胞样本的制作中，可能出现细胞破损，这样，在不打孔的情况下，核蛋白及在结合位点在胞内的蛋白也可能着色。
3.如果不知道某个蛋白是属于什么情况，要查文献。实在不知道，就打孔吧，因为不影响实验结果。
第二个问题，除了技术支持所说的，还有一个因素。
假设一抗是从动物一中得来的，二抗是从动物二中得来的。在二抗的制备过程中，不可避免含有动物二的自身抗体。而这些自身抗体可能与样本的非特异抗原结合形成非特异着色。
如果在二抗孵育前，先用来自二抗来源的血清封闭，二抗来源的血清含有动物二的自身抗体。
那么，这些自身抗体就会与样本的非特异抗原先结合。再加二抗后，则会大大减少二抗中自身抗体与样本的非特异抗原结合的机会。
BSA成分单一，也不含有动物二的自身抗体，封闭效果就不如二抗来源的血清。
第三个问题，影响因素较多。
1.不同细胞的固定方法，对实验结果确有影响。建议用4%多聚甲醛。
2.对于确定只在细胞膜结合的蛋白，可以不用triton X-100 破膜。缩短孵育时间，减少抗体浓度，增加清洗时间等等，都可以减少非特异着色。
3.如果经过反复调整实验流程，仍有非特异着色，考虑是抗体问题。

受益非浅，看来了解二抗来源同样很重要。