如何制备多克隆抗体...

如何制备多克隆抗体

一、多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤：
1、制备抗原。
2、选择实验动物。
3、动物免疫。
4、试取血进行测试，看看是否成功免疫。
5、如果成功免疫，杀死实验动物，采集全部血清。
6、纯化出抗体。
7、鉴定抗体。包括纯度以及特异性。
二、抗体分类
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。多克隆抗体是由异源抗原（大分子抗原、半抗原偶联物）刺激机体产生免疫反应，有机体浆细胞分泌的一组免疫球蛋白。多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。
三、免疫方法
可以采用以下各种方法之一进行免疫。
（1）淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗 50mg（每侧约0.30ml） 。7～10 天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG 乳化抗原 0.50ml(含 IgG 5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml)；③必要时，14 天后，重复步骤②一次；④再过 7 天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的 IgG 乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml） ；⑤5～7天后，耳静脉采血。测定血清效价。
（2）皮下多点注射法：①家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原 0.10ml（IgG 含量5mg/ml） ；②7～10 天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各两点、共 6 点）皮下注射含不完全佐剂5的抗原，每点 0.50ml；③7～10 天后，脊柱两侧重复注射一次；④7～10 天后试血。不合格者重复步骤③。
（3）多途径联合注射法：①两侧掌（跖）内侧皮下注射含完全佐剂抗原 0.50ml（IgG 量为 5mg/ml） ；②14 天后，多点皮下注射含有不完全佐剂抗原；③7 天后，耳静脉注射不含佐剂的抗原 2ml；④测定血清抗体效价，不合格者重复步骤③，并适当递增 IgG 量。

目的是制备几种单克隆抗体的混杂物。

实验方案根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；
2. 第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3. 第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧 窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧 窝及鼠蹊部皮下。
4. 间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
5. 若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

我们实验室现在通用的方案是:
第一次免疫：1ml弗氏完全佐剂(FCA)与100ug蛋白抗原／1mlPBS（一只兔子用量）充分研磨混匀，达到“油包水”的状态，分四点注射：双腋下、腹股沟。
第二次免疫：间隔4周，换用弗氏不完全佐剂，其余同第一次免疫
第三次免疫：同上
测定血清效价，间接ELISA，10ug／ml抗原包被，效价1:64000以上可以放血，也可以再加强免疫一次：生理盐水稀释抗原，耳缘静脉注射，一周内放血展开