【求助】自己制备的多克隆抗体做WB有三条带...

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【求助】自己制备的多克隆抗体做WB有三条带

skykiller

举报 2009-10-29 20:13

genius_at
制备出的抗体通过了GST的柱子消除了与我的抗原有交叉反应的抗体

这句可能有问题。是商品化纯化GST融合蛋白的柱子吗？那是不对的。应该用纯化的GST蛋白接柱去纯化多抗，消除可能的交叉。

另外，多抗的特异性抗体含量一般不超过20%，最好过一次自己的抗原柱进行特异性的纯化。

mwliu

举报 2009-10-24 12:19

如果你觉得纯化没问题，那就看看你的蛋白是否有二聚体或是降解，还有，如果你的抗体可以IP的话，可以试试做个IP后再来做WB，条带会比较单一。

genius_at

举报 2009-10-23 16:25

skykiller
这句可能有问题。是商品化纯化GST融合蛋白的柱子吗？那是不对的。应该用纯化的GST蛋白接柱去纯化多抗，消除可能的交叉。

另外，多抗的特异性抗体含量一般不超过20%，最好过一次自己的抗原柱进行特异性的纯化。

谢谢！可能是我没说明白，不是商品化纯化的GST融合蛋白的柱子。是与我所要蛋白有交叉反应的同一家族的另一个成员的GST融合蛋白，这样既把GST交叉反应抗体给去掉，又把这个家族成员的抗体给去掉了。现在我过了一下我所要的蛋白的GST融合蛋白的柱子来抓抗体，那些杂带没有结合，在过抗体的时候就给去掉了，但是我之后用GST洗脱液洗脱后的液体做WB也没有带了，是不是需要再过一下Millpore Montage的抗体纯化试剂盒还是洗脱液的PH值不对呢？

genius_at

举报 2009-10-31 01:49

mwliu
如果你觉得纯化没问题，那就看看你的蛋白是否有二聚体或是降解，还有，如果你的抗体可以IP的话，可以试试做个IP后再来做WB，条带会比较单一。

谢谢！我觉得还是纯化的问题~~

skykiller

举报 2009-10-30 13:06

genius_at
谢谢！可能是我没说明白，不是商品化纯化的GST融合蛋白的柱子。是与我所要蛋白有交叉反应的同一家族的另一个成员的GST融合蛋白，这样既把GST交叉反应抗体给去掉，又把这个家族成员的抗体给去掉了。

这一步应该收集的是柱穿透样，是吧？

genius_at wrote:
现在我过了一下我所要的蛋白的GST融合蛋白的柱子来抓抗体，那些杂带没有结合，在过抗体的时候就给去掉了，但是我之后用GST洗脱液洗脱后的液体做WB也没有带了

有洗脱峰吗，纯化抗体浓度、纯化的规模有多大？用什么溶液洗脱的？

genius_at wrote:
是不是需要再过一下Millpore Montage的抗体纯化试剂盒还是洗脱液的PH值不对呢？

个人没有用过这个试剂盒。但如果是通用性的纯化抗体试剂盒，应该也就是Protein A/G之类的方法。前面已经用抗原亲和柱纯化过了，再过这个柱没有意义。