【求助】多克隆抗体，原来是单一带，后出现了杂带？...

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【求助】多克隆抗体，原来是单一带，后出现了杂带？

举报 2009-08-12 02:46

如果抗体稀释浓度没问题的话，很可能的2个原因：1 蛋白样品离心不彻底，样品中含非溶解性污染蛋白。2 样品可能有些降解。建议增加离心速度或延长时间；样品中加入蛋白酶抑制剂，祝你成功！

举报 2009-08-07 12:46

谢谢。我试试看。也就是说抗体出问题的可能性不大，是吗？前后的实验，都是同样的稀释比例。

举报 2009-08-07 18:41

(1)曝光时间：如果荧光教强，而曝光时间相对较长，很容易在条带附近多曝出几条带，建议你重新孵二抗，缩短曝光时间试试。
（2）二抗，二抗有没有换，浓度和孵育时间有没有改变，如果有改变，很可能是二抗造成的，

举报 2009-08-14 11:42

puxiaoyu
(1)曝光时间：如果荧光教强，而曝光时间相对较长，很容易在条带附近多曝出几条带，建议你重新孵二抗，缩短曝光时间试试。
（2）二抗，二抗有没有换，浓度和孵育时间有没有改变，如果有改变，很可能是二抗造成的，

二抗没有换过。一直都是santa的。曝光时间很短了。就十几秒。因为我肉眼能看到很强的荧光。可能二抗需要降低浓度。

举报 2009-08-14 19:16

你压五秒试试看，显影液里不要待得时间太长了，我还做过把胶片在荧光上压一下，两三秒就立即显影的。如果荧光那么强，十几秒也算很强的了。你可以把你那张膜重复做，不需要重新跑。再孵二抗就可以了。

举报 2009-08-06 05:19

我做组织蛋白也出现楼主这样的问题，可以排除一抗，二抗的问题。目前锁定在提蛋白上，500RIPA+5PMSF（单位都是ul）12000转15MIN离心，

举报 2009-08-13 10:54

tongsu
我做组织蛋白也出现楼主这样的问题，可以排除一抗，二抗的问题。目前锁定在提蛋白上，500RIPA+5PMSF（单位都是ul）12000转15MIN离心，

是的，后来我做了一个对照，把以前作出单一条带的样品又跟着一起跑了，发现是正常的，那就排除了抗体的问题。提取蛋白的时候，可能吸到了下面的沉淀，我12000g,5分钟。看来离心时间还要延长一点

举报 2009-08-06 00:33

楼主的Loading Buffer是不是新配的，如果是用了很长时间的loading Buffer 来变性，蛋白中的二硫键不能完全打开，WB的时候会出现你描述的在目的蛋白下很近的地方有条带，并且能被抗体识别。

举报 2009-08-06 20:27

多谢大家的帮忙。我会继续排查。

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