收藏  |   举报 2009-08-05 10:45   关注:230   回答:9

【求助】多克隆抗体,原来是单一带,后出现了杂带?...

已解决 悬赏分:0 - 解决时间 2024-11-14 04:12
【求助】多克隆抗体,原来是单一带,后出现了杂带?
举报 2009-08-12 02:46
如果抗体稀释浓度没问题的话,很可能的2个原因:1 蛋白样品离心不彻底,样品中含非溶解性污染蛋白。2 样品可能有些降解。建议增加离心速度或延长时间;样品中加入蛋白酶抑制剂,祝你成功!
举报 2009-08-07 12:46
谢谢。我试试看。也就是说抗体出问题的可能性不大,是吗?前后的实验,都是同样的稀释比例。
举报 2009-08-07 18:41
(1)曝光时间:如果荧光教强,而曝光时间相对较长,很容易在条带附近多曝出几条带,建议你重新孵二抗,缩短曝光时间试试。
(2)二抗,二抗有没有换,浓度和孵育时间有没有改变,如果有改变,很可能是二抗造成的,
举报 2009-08-14 11:42
puxiaoyu
(1)曝光时间:如果荧光教强,而曝光时间相对较长,很容易在条带附近多曝出几条带,建议你重新孵二抗,缩短曝光时间试试。
(2)二抗,二抗有没有换,浓度和孵育时间有没有改变,如果有改变,很可能是二抗造成的,


二抗没有换过。一直都是santa的。曝光时间很短了。就十几秒。因为我肉眼能看到很强的荧光。可能二抗需要降低浓度。
举报 2009-08-14 19:16
你压五秒试试看,显影液里不要待得时间太长了,我还做过把胶片在荧光上压一下,两三秒就立即显影的。如果荧光那么强,十几秒也算很强的了。你可以把你那张膜重复做,不需要重新跑。再孵二抗就可以了。
举报 2009-08-06 05:19
我做组织蛋白也出现楼主这样的问题,可以排除一抗,二抗的问题。目前锁定在提蛋白上,500RIPA+5PMSF(单位都是ul)12000转15MIN离心,
举报 2009-08-13 10:54
tongsu
我做组织蛋白也出现楼主这样的问题,可以排除一抗,二抗的问题。目前锁定在提蛋白上,500RIPA+5PMSF(单位都是ul)12000转15MIN离心,


是的,后来我做了一个对照,把以前作出单一条带的样品又跟着一起跑了,发现是正常的,那就排除了抗体的问题。提取蛋白的时候,可能吸到了下面的沉淀,我12000g,5分钟。看来离心时间还要延长一点
举报 2009-08-06 00:33
楼主的Loading Buffer是不是新配的,如果是用了很长时间的loading Buffer 来变性,蛋白中的二硫键不能完全打开,WB的时候会出现你描述的在目的蛋白下很近的地方有条带,并且能被抗体识别。
举报 2009-08-06 20:27
多谢大家的帮忙。我会继续排查。
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