【求助】急急急急急！求高手相助，关于使用His标签蛋白纯化抗...

【求助】急急急急急！求高手相助，关于使用His标签蛋白纯化抗体！

求好心人指点 啊！！！！！！！！55555555555

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蜜兜
楼主新手，最近在做一个蛋白的抗体，表达了目的蛋白的GST融合蛋白送去免疫兔子，现在收到了返回的抗体，想用His标签的融合蛋白对抗体进行纯化，我只知道Ni柱纯化His标签蛋白的方法，最终是要用咪唑洗下融合蛋白，但是现在想把His标签与Ni柱之间的结合固定，从而纯化洗脱抗体，但是不知道 His标签与Ni柱固定的的方法...！！！老板发飙了，小女子**大神指点啊 55555

......

好复杂啊，我硬是没看明白！！

GST-Ag免疫，得到的多抗是兔抗-GST-Ag，
然后HIS-Ag去纯化兔抗-GST-Ag，
你想把HIS-Ag挂到Ni柱上，再挂兔抗-GST-Ag，得到兔抗--Ag，排除兔抗-GST，对吗？
何必这样设计实验呢？而且行不通啊

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loud2008
好复杂啊，我硬是没看明白！！

GST-Ag免疫，得到的多抗是兔抗-GST-Ag，
然后HIS-Ag去纯化兔抗-GST-Ag，
你想把HIS-Ag挂到Ni柱上，再挂兔抗-GST-Ag，得到兔抗--Ag，排除兔抗-GST，对吗？
何必这样设计实验呢？而且行不通啊

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是的是的，就是这个意思，我的确没做过抗体相关的东西，在实验室前辈指导下做的，大体的意思就是您说的那个可以直接出去抗GST，因为用GST标签纯化的话要先把抗体过一遍GST蛋白，去掉抗-GST，再拿这个流穿过GST-抗原融合蛋白.....不知道您是怎么做的啊，而且这个为什么不可能啊？是Ni 没法和His交联吗？

蜜兜
是的是的，就是这个意思，我的确没做过抗体相关的东西，在实验室前辈指导下做的，大体的意思就是您说的那个可以直接出去抗GST，因为用GST标签纯化的话要先把抗体过一遍GST蛋白，去掉抗-GST，再拿这个流穿过GST-抗原融合蛋白.....不知道您是怎么做的啊，而且这个为什么不可能啊？是Ni 没法和His交联吗？

纯化抗体常用的是用溴化氢活化的柱子和你的蛋白交联再用来纯化抗体。

reyesa
纯化抗体常用的是用溴化氢活化的柱子和你的蛋白交联再用来纯化抗体。

真是非常感谢你，还想请教这个柱子是固定蛋白的原理是什么啊？跟His标签有关系吗？

蜜兜
真是非常感谢你，还想请教这个柱子是固定蛋白的原理是什么啊？跟His标签有关系吗？

你想做的是经典的抗原亲和纯化。就是用溴化氢的活化柱直接和你的蛋白化学交联。跟his没有关系的

reyesa
你想做的是经典的抗原亲和纯化。就是用溴化氢的活化柱直接和你的蛋白化学交联。跟his没有关系的

明白了，reyesa ，谢谢你的耐心解释，非常感激：）

溴化氢的活化Sephrose 4B连接HIS-Ag，与你得到的多抗结合，再洗脱，得到目的抗体。
或者溴化氢的活化Sephrose 4B连接GST，与你的多抗结合，收集流穿，得到目的抗体。
这样的话，实验很难，为什么不在第一步，免疫的时候直接去掉GST啊？
或者验证一下，你得到的多抗不跟GST反应，不就可以了？
最好，做单克隆抗体！！
老板发飙不应该啊，得补课啊

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loud2008
溴化氢的活化Sephrose 4B连接HIS-Ag，与你得到的多抗结合，再洗脱，得到目的抗体。
或者溴化氢的活化Sephrose 4B连接GST，与你的多抗结合，收集流穿，得到目的抗体。
这样的话，实验很难，为什么不在第一步，免疫的时候直接去掉GST啊？
或者验证一下，你得到的多抗不跟GST反应，不就可以了？
最好，做单克隆抗体！！
老板发飙不应该啊，得补课啊

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嗯嗯，谢谢你的指点，表达的时候是GST融合蛋白，用GSTbeads纯化的，你说的去掉GST是怎么操作呀？