辣根过氧化物酶的活性测定方法...

辣根过氧化物酶的活性测定方法

过氧化物酶（辣根过氧化酶，181U/mg）溶液（约0℃）：取1.7mg过氧化物酶（Serva, Nr,31943）溶于5ml蒸馏水。
　　辣根，别名：马萝卜，拉丁学名：Armoracia rusticana.属罂粟目，十字花科、辣根属多年生直立草本。全体无毛。根肉质肥大，纺锤形，白色，下部分枝。茎粗壮，表面有纵沟，多分枝。原产欧洲东部和土耳其，已有2000多年的栽培历史。中国的青岛、上海郊区栽培较早，其他城郊或蔬菜加工基地有少量栽培。根有特殊辣味，含烯丙（基）硫氰酸（C3H5CNS），磨碎后干藏，备作煮牛肉及奶油食品的调料，或切片入罐头中调味。中国自古药用，有利尿、兴奋神经之功效。还具有较强的抗癌效果。

测酶活性的实验：
.用萃取化学公司法（Amano法的改进型）测定葡萄糖氧化酶
（1）试剂
① 磷酸盐缓冲液（pH7.0）：取6.805g磷酸二氢钾(KH2PO4; Merck, Art.4873)溶于350mL蒸馏水中。用1M氢氧化钠溶液(NaOH (4g溶于100ml水))将pH值调至7.0，用蒸馏水定容至500mL。
② 邻-联二茴香胺(o-Dianisidine)溶液：取1.7mg邻-联二茴香胺（C14H16N2O2; Serva, Nr,19175）溶于25ml磷酸盐缓冲液。
③ 过氧化物酶（辣根过氧化酶，181U/mg）溶液（约0℃）：取1.7mg过氧化物酶（Serva, Nr,31943）溶于5ml蒸馏水。每毫升此溶液中应含有60个红紫倍精单位。
④ 底物溶液（约0.55M）：取5.0gβ－D－葡萄糖（C6H12O6; Sigma, No.G-5250）溶于蒸馏水中，定容至50mL。
使用前，至少得将此酶静置3h。
⑤ 酶（待测的葡萄糖氧化酶）溶液：用磷酸盐缓冲液溶解该酶。1mL配制的酶溶液中应含有大约0.1U。
0.0037g溶于500μl PBS, 再取10μl前者溶液定容至100PBS（约0.1U/ml）。
测酶活性（118U/mg）的实验2
（1）操作步骤：将0.50mLβ－D－葡萄糖溶液、0.10mL在冰水中冷却过的过氧化物酶（辣根过氧化酶）溶液和2.4mL邻-联二茴香胺溶液滴入一只小烧杯内混合，调温至25℃，然后将其全部加到1cm的比色皿内，最后加0.1ml酶于待测的葡萄糖氧化酶溶液，同时按动秒表。在连续15min内每隔1min于436nm处测一次吸光度
(2)计算：用以下公式计算活性：

式中：E436――每分钟吸光度的变化（436nm处）(15次的平均值)
Ew――0.1ml所用酶液中含酶的重量（0.000074mg）
8.3――1μmol邻-联二茴香胺/mL的吸光度（436nm处）
3.1――反应混合物的总体积
U1=53.25U/ mg; U2=93.21U/ mg; U3=13.30U/ mg
测酶活性（118U/mg）的实验5(061218)
（1）操作步骤：将333μlβ－D－葡萄糖溶液、67μl在冰水中冷却过的过氧化物酶（辣根过氧化酶）溶液和1.6mL邻-联二茴香胺溶液滴入一只1cm的比色皿内，调温至25℃，最后加67μl酶于待测的葡萄糖氧化酶溶液，搅拌均匀(搅拌同时计时，共用8s，)，然后重新按动秒表。在连续15min内每隔1min于436nm处测一次吸光度
(2)计算：用以下公式计算活性：

式中：E436――每分钟吸光度的变化（436nm处）(15次的平均值)
Ew――67μl所用酶液中含酶的重量（0.00004958mg）
8.3――1μmol邻-联二茴香胺/mL的吸光度（436nm处）
2.067――反应混合物的总体积
GOD:
15min的平均值：
U1=181.23U/mg; U2=167.36U/ mg; U3=156.11U/ mg
4min的平均值：
U1=156.56U/ mg; U2=129.89U/ mg, U3=134.97U/ mg展开