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2018-01-17 10:15
缓冲溶液的作用主要就是pH稳定性和离子强度的适合,还有避免缓冲溶液中的成分与样品分子发生共价链接,主要就是考虑这些。
链接很容易,就用EDC或者CMC等碳二亚胺,是最容易在羧基和氨基之间催化形成酰胺键,反应条件就是0到4度,过夜,用磁力搅拌子温和搅拌,pH<7反应快,不过pH=7或稍微pH>7也关系不大。EDC或者CMC等碳二亚胺催化活性极高,而且一般的蛋白质的分子表面总有Lys,Arg,Asn,Gln,所以游离在分子表面的羧基和氨基总是不少的,参与反应的两种蛋白质用大致10:1的比例混合(哪种蛋白质便宜,哪种蛋白质的物质的量就大些,但是这不是全部原因),反应样品浓度就按照平时使用时的浓度或略微更低浓度(别用储存液的浓度)即可。很容易反应,而且EDC或者CMC等碳二亚胺是零臂连接试剂,用于空间位阻,形成多分子交联可能较小,即使形成了也很容易用分子筛层析按照分子量区分开。 参与反应的两种蛋白质用大致10:1的比例混合(哪种蛋白质便宜,哪种蛋白质的物质的量就大些,但是这不是全部原因),为了避免两种蛋白质之间发生交联成为串联,因为一种蛋白质形成串联的可能性低一些;即使要形成串联的蛋白质串珠,最好也不要是价格高的那种;另外,EDC或者CMC等碳二亚胺催化活性极高,室温下即会催化,所以要在0到4度,过夜,用磁力搅拌子温和搅拌,一方面避免碳二亚胺催化活性太高形成串联的蛋白质串珠,另一方面,保护蛋白质不变性;反应样品浓度就按照平时使用时的浓度或略微更低浓度(别用储存液的浓度)即可,为什么?因为浓度高了更易形成串联的蛋白质串珠结构,浓度低了,没有反应成功,通过分子筛层析还可以分离出来接着连接,如果形成了酰胺键再要专一性切开就没有那么容易了。 |