【求助】如何提到细胞总蛋白的抽提...

【求助】如何提到细胞总蛋白的抽提

建议买一瓶碧云天的蛋白提取裂解液，非常好用，比自己配的裂解液要好。价钱不是很贵

我也提过总蛋白，浓度也不过2，如果提取过程没有出入，单纯是提高蛋白浓度的话，可以用冷冻干燥来解决

请问楼主你每次用PBS洗细胞完毕的时候，就是在加裂解液之前，是否将离心管中的PBS完全倒干净，如果你只是倒出来那还是不够的，残存的PBS会降低裂解液的浓度导致蛋白浓度降低。我每次的经验就是把离心管中的PBS倒出来以后，再用200ul的枪慢慢把残余的PBS全部吸干净，但是注意不要把细胞沉淀吸出来，然后我是每50ml细胞培养瓶加200ulRIPA，我这样做的话蛋白浓度一般都有5ul/ug左右，你可以试试。

目前市面上常见的细胞/组织裂解液有两种：
1、RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay) 裂解液：一种经典的动物组织/细胞快速裂解液，对细胞膜、胞浆亚组分、胞核成分均有较强裂解作用。使用RIPA制备的蛋白提取物适用于后续的Western Blotting和免疫共沉淀(IP)的研究。2、非变性组织/细胞裂解液：可以在非变性条件下裂解细胞，释放胞浆、胞核、细胞膜和细胞亚组分蛋白。与RIPA裂解液相比，因其具有以下优点，在近几年被广泛应用。
（1）最大程度地保留蛋白原有特性和功能，如维持原有蛋白结构 (native form)，维持原有蛋白间相互作用(protein-protein interaction)和酶学活性，因此特别适宜于免疫共沉淀、信号传递研究和酶动力学检测。
（2）有些抗体只能识别非变性蛋白的抗原位点或对非变性蛋白具有更高的结合能力，此情况下应使用非变性裂解液。
无论使用哪种裂解液都应该注意以下几点：
1、在裂解液临用前，需新鲜加入终浓度为1×的蛋白酶抑制剂复合物。最常使用的蛋白酶抑制剂，如PMSF、leupeptin、pepstatin等极易水解，15分钟即可降低50%的活性。
2、整个裂解步骤都要在冰浴或4℃操作。
3、贴壁细胞去除培养液，用PBS洗一遍。并尽可能去除残余的PBS。
4、建议每10^6个细胞加入0.1 ml裂解液。此条件下最终提取物蛋白浓度约在5～10 mg/ml范围。（个人经验）
5、裂解细胞时轻轻摇晃或用枪头轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触3～5分钟，然后全数转移到1.5 ml离心管。每隔5～6分钟振荡器轻柔振荡一次，振荡4次左右，保证细胞充分裂解。