基因组DNA提取中细胞裂解液怎么配制...

基因组DNA提取中细胞裂解液怎么配制

裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。这两种方法（包括SDS 和溶菌酶处理等）提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。
一、机械裂解法主要有以下两中：
1．热休克（Thermal shock），既反复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing）,。原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。
2．超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法，把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。bead-beating 也是常用的机械处理方式，有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高，但通常得到的DNA片段较小。
二、化学裂解和酶裂解法（在提核酸时联合使用）
主要是裂解液处理法，细胞裂解液的主要目的有以下几种：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。
主要根据不同的目的，裂解液的组成有所不同，主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时，我们主要是要充分裂解细胞，得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白，那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液，在提取蛋白后，再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：
50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），蛋白酶K等。