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2017-10-03 14:09
试剂准备：使用前先在SEWS-M Wash Solution中加入100 ml 100%的乙醇，混匀。在瓶子上做好标记，密闭储存于室温条件。提取步骤：1. 在样品处理管E中加入至多500 mg的土壤样品2. 将978 μl的Sodium Phosphate Buffer加入到样品处理管E中3. 再加入122 μl的 MT Buffer（为了得到良好的样品处理效果，请在加入土壤样品及两个缓冲液后，在样品处理管中仍能保留有250 – 500μl 空间）4. 将样品置于FastPrep? 仪器上，样品处理条件一般为，时间：40秒，速度：6.0（如果样品需要额外的处理时间，请在间隔期将样品处理管在冰上孵育至少2分钟，以免样品过热）5. 14,000 x g离心5~10分钟（如果把离心时间延长到15分钟，可以更好地使样品量较大的；或者细胞壁结构较复杂的细胞的碎片沉降到管底）6. 将上清转移到一个干净的2.0 ml离心管中。加入250μL的PPS溶液（蛋白质沉淀溶液），用手摇晃10次，使之充分的混合。7. 14,000 x g离心5分钟，将上清转移到一个干净的15ml管中(此处也可使用2Ml管，但使用大管子能获得更好的混合和DNA绑定效果)8. 重悬硅珠（Binding Matrix）溶液，将1.0 ml重悬液加入该15ml管中。9. 使用振荡器或者手动震荡2分钟，将DNA绑定在硅珠上。将管子置于管架上，静置3分钟，使硅珠沉淀下来。10. 小心地移除500μl的上清液，避免吸取到沉淀下来的硅珠。11. 将硅珠在剩余的上清液中重悬。转移约600μl的重悬液至SPIN? Filter中，14,000 x g离心1分钟。弃去接液管中的废液，将15ml管中剩余的重悬液转移到SPIN? Filter再次离心弃去废液。12. 加入500 μl事先准备好的SEWS-M溶液，用枪头轻轻吹打，小心地重悬沉淀。13. 14,000 x g离心1分钟，弃去废液。14. 不加其他溶液，将SPIN? Filter 14,000 x g离心2分钟，除去残留的SEWS-M溶液。弃去接液管，更换一个新的、干净的离心管。15. 将SPIN? Filter置于室温下晾干5分钟16.轻轻地用50-100 μl 的DES溶液（或者无菌/无DNA酶的水）重悬SPIN filter上的硅珠（为了避免过度稀释纯化出的DNA，请尽量减少DES溶液的量，55?C孵育5分钟能帮助提高纯化产物的得率）17. 14,000 x g离心1分钟使溶解的DNA转移到接液管中。弃去SPIN? Filter（得到的纯化产物可直接用于PCR等其他下游的操作，4°C使用前保存或者-20°C长期保存。）技术优势
能有效的处理土壤样品中一些很难处理的组分如： 真细菌孢子（eubacterial spores）、内芽孢（endospores）、格兰仕阳性菌（gram positive bacteria）、酵母（yeast）、线虫（nematodes）、海藻（algea）、真菌（fungi）等。2. 样品处理过程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整个提取过程中有效的保护核酸，并最大限度的降低RNA污染。3. 基于硅珠的纯化方法，可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制物4. 纯化所得的DNA可直接用于PCR、酶切都后续实验之中。5. 对腐植酸含量特别高的样品，附加额外的处理方法。注：对于去除腐植酸的方法在使用以下任何一种方法之前，请预先准备5.5M的异硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）溶液方法A：1.当操作到土壤DNA提取试剂盒的第九步时，使用14,000 x g (~约5秒)的短时离心替代硅珠的自然沉降，移除上清。2.用1ml事先准备好的异硫氰酸胍溶液洗涤、重悬硅珠。3.14,000 x g (~约5秒)短时离心该离心管，除去上清。4.重复上述的洗涤步骤，直到硅珠恢复到原先的颜色。5.最后一次洗涤之后，用1ml的异硫氰酸胍溶液重悬硅珠，将600μl重悬液转移到SPIN filter里，14,000 x g离心1分钟。6.移除接液管中的废液，将剩余的重悬液转移至SPIN filter里，14,000 x g离心1分钟，弃去废液。7.从提取试剂盒操作说明的第十二步开始继续操作。方法B：1.将下列成分混合于1.5ml的离心管中，组成腐植酸洗涤液：978 μl Sodium Phosphate Buffer122 μl MT Buffer250 μl PPS2.充分混匀后，全速离心1分钟，将上清转移到一个新的离心管中（容量大于或等于2ml）3.加入等体积的5.5M的异硫氰酸胍溶液、混匀。4.完成了土壤试剂盒操作说明中的第九步后，将500μl的腐植酸洗涤液加入SPIN filter5.14,000 x g离心1分钟，弃去废液。6.重复上述的洗涤步骤，直到硅珠恢复到原先的颜色。7.从提取试剂盒操作说明的第十二步开始继续操作。 |
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