T4DNA连接酶酶连接总是连接不上...

What is the vector for this subcloning? What are the two enzymes used for this cloning? How big is the insert DNA? What is the ligation reaction and how is transfomation performed?

mpark

What is the vector for this subcloning? What are the two enzymes used for this cloning? How big is the insert DNA? What is the ligation reaction and how is transfomation performed?

酶切位点是BamHI和AatII 因为两种酶不能进行双酶切 只能先BamHI但酶切再AatII酶切。插入基因1000bp左右 载体片段8000bp左右 用T4连接酶反应 酶1ul buffer2ul 目的基因3ul 载体8ul水6ul 感受态确定没有问题 酶也是刚买的 但就是连不上 做了好几次了

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wnan2320

酶切位点是BamHI和AatII 因为两种酶不能进行双酶切 只能先BamHI但酶切再AatII酶切。插入基因1000bp左右 载体片段8000bp左右 用T4连接酶反应 酶1ul buffer2ul 目的基因3ul 载体8ul水6ul 感受态确定没有问题 酶也是刚买的 但就是连不上 做了好几次了

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转化后 抗性平板不长菌

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zweiguang
质粒酶切后三条带据说是超螺旋 线性 环状 三种

你是要连还是要切 我没太搞懂

连的话 首先要有目的片段 一般由PCR获得 引物上设计酶切位点及保护碱基 PCR产物酶切 质粒酶切 然后二者均经过胶回收纯化 然后连接目的片段也可以以质粒为模板进行PCR获得

关键 要连上 目的片段的酶切位点与质粒上的酶切位点要一致 注意方向 要保证方向正确 通常两端用不同的酶切位点且切完后形状，粘性末端序列，长度最好有明显差别

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方向没有错，现在问题是 我的目的基因和目标载体连接不上，目的基因和载体分别先用BamHI单酶切再用AatII酶切后，胶回收用T4连接酶连接，但转化大肠后总是不长菌

How did you prepare 1000 bp insert DNA, cut from other construct, or amplify it from PCR? If it is from PCR, try to make blunt-end ligation first.

我看了一下，这两个酶切出的粘性末端都是四个碱基，我不会选择这么长粘性末端的酶，我觉得它会断。

也不会选择用两个酶进行两次酶切，两次胶回收。浓度会严重下降。

建议重新选酶，尽量选酶切条件一致的，同时进行酶切，然后胶回收，然后连接。

因为我的载体上就四个酶切位点，第一个和第二个紧挨着，第四个酶切是平末端，所以只能选这两个酶切位点。另外这两个酶不能同时双酶切，所以才分别单酶切的，我也不想分别单酶切的。真的是好苦恼呀。。。。。。