T4连接酶连不上，求各位大神帮忙！！！...

T4连接酶连不上，求各位大神帮忙！！！

图2：在20 µl反?µ逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。

二、常见问题及解答

Q1：有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败?
A1：
反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。
反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。
去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。
插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
加入过多的连接混合物至感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。
插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。
连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。
电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB# M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。

Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？
A2：
感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。
细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。
大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB＃E8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。
连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。
插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。
重组子太大（>10,000 bp）不能进行化学转化：用电转化。

Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败？
A3：
内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。
内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。
内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。
DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。

Q4：使用T4 DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNA。
A4：注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。
转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。
转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1％。
酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤1相近。
酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1的1％。

Q5：什么情况下选用T4 DNA连接酶？
A5：T4 DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要过夜。如果需要热失活连接酶，选用用T4 DNA连接酶。高浓度T4 DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构。

Q6：T4 DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？
A6：可以，高浓度T4 DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4 DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。

Q7：T4 DNA连接酶连接应该加多少DNA？
A7：单位定义用的是0.12 μM (300 μg/ml) lambda HindIII。高浓度的DNA用于linker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平。载体＋片段总浓度应为：1-10 μg/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。

Q8：T4 DNA连接酶可在其它NEBuffers中使用吗？
A8：连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer中进行，但需要加终浓度为1mM ATP。确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。当使用NEBuffer 3时，如果DNA中盐浓度较高可导致连接效率下降。

Q9：T4 DNA连接酶可以热失活吗？
A9：可以，65 °C孵育20分钟可以失活。如果buffer【快速连接试剂盒（NEB# M2200）内的buffer】中含有PEG则不可热失活，否则会抑制转化。

Q10：Weiss单位（韦氏单位）与NEB粘性末端单位如何换算？
A10：一个NEB粘性末端单位等于0.015 Weiss单位，即一个Weiss单位等于67个NEB粘性末端单位。

二、关于NEB M2200 T4 DNA 快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答

1、产品特性介绍以及使用方法
产品说明：本试剂盒可在室温(25°C)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。

应用：

DNA片段克隆入载体
文库构建
TA克隆
Linker连接
线性DNA的再环化

快速连接试剂盒的优点：

快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成
方便-可在室温条件下进行连接反应
灵活-适合于各种常规连接反应

试剂盒成分：

Quick T4 DNA 连接酶(重组酶)
2X Quick Ligation Buffer
贮存条件 (连接酶)：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%甘油。

2XQuick Ligation Buffer：132 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM ATP，15%Polyethylene glycol(PEG 6000)*， pH 7.6@25°C。
* 美国专利号：4,582,802。

注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。

快速连接步骤:

混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10 µl。
加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀。
加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，彻底混匀。
稍事离心，室温 (25°C) 作用5分钟。
冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。
不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。
转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法：

冰上融化感受态细胞。
在1.5 ml微量离心管中，将约5 ng (2 µl)的连接混合物冷却。
在DNA样品中加入50 µl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。
冰上放置30分钟。
37°C热休克2分钟，冰上冷却5分钟。
加入950 µl室温培养基，37°C温育1小时。
取100 µl样品铺在适宜的培养基上。
37°C培养过夜。

注意事项： 用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25°C 5分钟达到反应终点, 超过这个时间效果并不会更好。事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25°C反应过夜，则转化效率会降至75%。

待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。要获得最适连接，在加2× Quick Ligation Buffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10 µl。DNA片段体积大于10 µl的，则相应增加2× Quick Ligation Buffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。

为保证有效连接， 总的载体DNA+插入片段的浓度应当在1-10 µg之间。对单插入来说，插入片段:载体比例在2-6之间最好, 低于2:1就会导致低的连接效率, 高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的比例做几个连接反应。

电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低PEG浓度。我们推荐使用柱离心式DNA纯化方法。

连接进程曲线：LITMUS28载体(NEB #N3628)经EcoRⅤ切割(平滑末端)或Hind Ⅲ切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自ΦX174 DNA的Hae Ⅲ消化产物(平滑末端)或λDNA的Hind Ⅲ消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB-amp平板上37°C生长过夜。

实验方案及应用示例：

质粒的再环化：用50 ng不含插入片段的线性载体通过快速连接程序进行。

示例：LITMUS 28克隆载体经Hind III消化后，反应混合物65°C温育20分钟使内切酶失活，然后用快速连接程序使DNA再环化并进行转化实验。

载体:2.5 µl (50 ng)
插入片段:无
水:7.5 µl
2X Quick Ligation Buffer:10 µl
Quick T4 DNA连接酶: 1 µl

结果 (转化子/ µg):
对照质粒(未切割)1.3 X 107
线性化质粒 1.1 X 104
再环化质粒2.1 X 107

粘性末端插入片段的连接：以50 ng线性去磷酸化的载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行。

示例：λDNA经Hind III消化后，两个 2kb片段经胶回收方法共纯化，插入到经Hind III切割并去磷酸化的pUC19载体上，通过快速连接程序连接DNA片段并转化。

载体:3.3 µl (50 ng)
插入片段(3:1):4.9 µl (122.5 ng)
水:1.8 µl
2X Quick Ligation Buffer:10 µl
Quick T4 DNA连接酶: 1 µl

结果 (转化子/ µg):
对照质粒(未切割)2.0 X 107
不含插入片段的载体 1.1 X 105
载体 + 插入片段 2.1 X 106

平滑末端插入片段的连接：用50 ng线性去磷酸化载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行该实验。

示例：以λDNA为模板，通过PCR方法获得两端含EcoR V酶切位点的1.9 kb片段，经EcoR V消化后产生平滑末端，然后插入到经EcoR V消化并去磷酸化的LITMUS 28载体上，DNA片端通过快速连接程序连接并转化。

载体:2 µl (50 ng)
插入片段(3:1):1.7 µl (103 ng)
水:6.3 µl
2X Quick Ligation Buffer:10 µl
Quick T4 DNA连接酶: 1 µl

结果 (转化子/ µg):
对照质粒(未切割)1.1 X 107
不含插入片段的载体 5.0 X 103
载体 + 插入片段 1.4 X 105

Linker 的连接：用50-250 ng平滑末端DNA和20倍过量的Linker通过快速连接程序进行该实验。如果需要，可以按比例调整该程序以进行大批量DNA连接。

示例：通过快速连接程序，将经EcoR V消化并去磷酸化的LITMUS 28载体与包含有Hind III酶切位点的Linker (8 bp)相连。连接产物纯化后，Hind III消化，然后再纯化并用快速连接程序环化。

载体:6.7 µl (1 µg)
Linkers (20:1):3.5 µl (20 pmols)
水:34.8 µl
2X Quick Ligation Buffer: 50 µl
Quick T4 DNA连接酶: 5 µl

结果 (转化子/ µg):
对照质粒(未切割)6.2 X 106
不含linkers的载体 3.0 X 103
Hind III 切割的载体 3.9 X 106
载体 + linkers 2.0 X 105

末端摩尔浓度的计算：摩尔浓度=[( µg/ µl)÷(碱基对×650道尔顿)]×2个末端

举例：

计算一个浓度为250 ng/ µl的5 kb线性化载体的末端摩尔浓度：
[(0.25 µg/ µl) ÷ (5000 X 650 daltons)] X 2 = 154 nM
如果将50 ng这个载体加入到20 µl连接反?µ逑抵校?偌扑隳┒四Χ?ǘ龋?
50 ng ÷ 20 µl = 0.0025 µg/ µl
[(0.0025 µg/ µl) ÷ (5000 X 650)] X 2 = 1.54 nM

要达到3:1的插入片段：载体比例，计算一下需加多少1 kb的插入片段：
3 X 1.54 nM = 4.62 nM
[(? µg/ µl) ÷ (1000 X 650)] X 2 = 4.62 nM
0.0015 µg/ µl X 20 µl = 0.03 µg = 30 ng
这个反应处在1-10 µg/ml的最适范围内吗？
(50 ng vector + 30 ng insert) ÷ 20 µl = 4 µg/ml

2、快速连接试剂盒常见问题及解答

Q1: 在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化？
A1:可能的原因有：
快速连接反应被热失活了。快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。
快速连接混合液在电击之前没有纯化。快速连接缓冲液中含有的PEG会阻止电击反应。可以应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。
过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过30min，也不会获得更好的效果。
反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应。可以纯化一下DNA。
脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP）没有完全失活或去除。可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶（NEB#M0289）。因为热敏磷酸酶在65℃ 5min即可完全失活而无需纯化DNA。

另外一些影响因素：
缓冲液超过一年，其中的ATP已经降解。补加新鲜的ATP至终浓度为1mM。
DNA浓度过高，连接产物只有线性分子。建议总DNA浓度在1-10 μg/ml之间。
插入片段和载体没有磷酸基团。
感受态细胞中加入的连接反应混合物过多。建议用量： 50μl 感受态细胞中加入1-5μl混合物。
插入片段长度超过10 kb，反应条件无法满足环化要求。可以降低插入片段浓度。
限制性内切酶切割不完全。当用于PCR产物末端的切割时，建议在两端的酶切位点上加至少6个保护碱基。
限制性内切酶没有完全热失活。如果选用的内切酶不能被热失活可以用酚/乙醇纯化DNA。
内切酶消化过程中存在星活性，造成载体或插入片段的非特异性切割。可以通过凝胶电泳检测。如果出现一些多余的条带，应减少酶切过程中的酶用量或缩短反应时间。

Q2: 为什么转化会失败，可以进行哪些对照实验？
A2: a. 细胞已死或者并不是感受态。如果必要重新更换细胞，进行下述对照实验（i-iv）。
重组蛋白在E.coli中不兼容。可以利用pMAL系统（NEB#E8000S）将其与麦芽糖结合蛋白进行融合表达。另外也可以换成E.coli之外的表达系统。
连接后的DNA中含有纵列的倒置重复序列，E.coli无法识别。如果可以，去除重复序列。或换成E.coli之外的表达系统。

注意：每一个对照实验应选用相同的DNA浓度，通常每个转化的用量为0.1-1ng.
用没有切割的载体检测细胞活性以及质粒的抗性。在有抗性和没有抗性的平板上进行检测。
切割后的载体不要进行连接：以检测未切割的载体。可以利用胶纯化来去除残余的0.1%的未切割的载体。
将质粒（无插入片段）切割后进行再连接以检测连接活性以及DNA末端的完整性。对于没有切割过的质粒，应该有60-70%可以再连接.
切割，脱磷，然后连接质粒用于检测由于不完全脱磷引起的背景。对于没有切割的质粒应该<3%.

Q3: 快速连接试剂盒中提供的T4 DNA连接酶的浓度是多少？
A3: 2,000,000units/ml. 与NEB高浓度T4 DNA连接酶（NEB#M0202）相同。

Q4: 普通的T4 DNA 连接酶可以用快速连接缓冲液吗？
A4：当用于普通T4 DNA连接酶时，应将反应时间延长至15分钟。但是建议孵育时间不要超过30分钟。

请问，我的基因片段2200bp, 两端都是BamH 1粘性末端，载体长9500bp, 两端也都是该酶切位点，若用NEB的连接酶，常温连接，效率会怎样？转化呢？

xiao1988qing
请问，我的基因片段2200bp, 两端都是BamH 1粘性末端，载体长9500bp, 两端也都是该酶切位点，若用NEB的连接酶，常温连接，效率会怎样？转化呢？

xiao1988qing您好！

首先，您是用BamHI进行单酶切，载体切割一定要完全，否则转化后会长的都是载体；建议您要对载体进行去磷酸化反应，如果不做去磷酸化，可能会载体自连几率特别高，影响插入片段连接的效率；

其次，连接时，建议您按照上述的连接反应建议的条件进行，因为您的插入片段和载体都比较大，可能是不是很好连，所以要把注意事项都考虑到；如果可以的话，用高浓度的T4DNA连接酶进行连接，增大连接的效率；

再次，转化时，因为这种大于10kb的片段比较难转化，如果可以的话，最好是能够用电击的方式，这样能够提高转化效率

建议您阅读上述的连接酶相关问题，并结合自己的实验进行优化，常温连接时注意是室温（20-25度），如果是连接酶，那么建议是4小时以内，如果是快速连接试剂盒，那么建议最好是5分钟。

LZ你好，我有一个实验设计的，是同时把两段片段连接入载体。载体是pET15b，用NdeI和BamHI酶切。而两个片段，A 片段长2.4Kb，用NdeI和KpnI酶切，短片段B长200bp，用KpnI和BamHI酶切。然后酶切好的载体和两个片段一起加入T4连接酶连接。请问三个片段的比例多少为好，T4酶的用量和连接温度时间多少为好呢？

非常谢谢您的解答！
载体片段的话，我已经去磷酸化了。想在片段浓度和酶浓度上再试试。